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山羊繁殖季节性调控通路相关基因的克隆、多态与表达研究

黄冬维  
【摘要】:增加母羊的年产胎次可以大幅提高其生产效率。济宁青山羊具有常年发情的优良特性。本论文旨在通过检测山羊季节性繁殖调控通路相关基因的组织表达模式,同时对山羊繁殖季节性候选基因TSHB、DIO2和RFRP进行多态性研究,期望寻找到调控山羊繁殖季节性的关键基因和潜在分子标记,为通过分子标记辅助选择育种减少山羊繁殖季节性和进一步深入阐明山羊常年发情的分子调控机理提供理论依据。 采集春分过后的济宁青山羊与辽宁绒山羊成年母羊下丘脑、垂体、卵巢-子宫繁殖轴等24个组织,应用RT-PCR、SYBR Green法及Taqman探针法荧光定量PCR技术对目前与山羊繁殖季节性相关的通路基因在繁殖轴组织及其他组织的表达情况进行研究;在此基础上选取三个重要的通路节点基因TSHB、DIO2和RFRP进行序列克隆并在繁殖季节性不同的多个山羊品种进行遗传多态性研究,获得如下结果: KiSS-1、RFRP、TSHB、DIO3、AANAT、HIOMT以及MT1基因主要在山羊大脑表达,各个基因表达具有一定的组织特异性,可能与它们的功能专属性有关;而DIO2基因表达较为广泛,可能对动物机体活动有广泛调控作用。其次,KiSS-1、RFRP、TSHB、DIO2、AANAT及HIOMT基因表达水平在济宁青山羊及辽宁绒山羊两品种间部分繁殖轴组织有明显差别,可能与两品种的繁殖季节性差异有关。而DIO3及MT1组织表达规律性不强,其功能有待进一步研究。 克隆获得山羊TSHB基因两条DNA序列,一条包含了5’调控区和外显子1部分,长2614bp;另一条包含外显子2和外显子3,长1031bp。山羊TSHB基因含一个417bp长的编码区,编码138个氨基酸,该蛋白序列预测包含一段16个氨基酸残基的信号肽。TSHB基因序列在哺乳动物高度保守。研究还发现山羊TSHB基因存在五个多态位点,分别为:C53A、287-289位点的3bp Indel、584-617位点的34bp Indel、A1819C以及E2_72TA,五个位点处于强的连锁不平衡状态。研究结果表明这些位点的基因型分布在季节性品种和非季节性品种间存在显著差异。TSHB基因这五个连锁的多态位点可能与山羊繁殖季节性相关。 克隆获得山羊DIO2基因外显子2序列及部分3’侧翼序列共1043bp,该部分序列与牛DIO2相应序列同源性高达96%。检测到山羊DIO2基因两个SNP位点:A273G和A896G。A273G突变位于编码区,且造成了编码氨基酸的改变(Gln103Arg),为错义突变;统计发现该突变在所检测的6个山羊品种中突变率均低于0.1,是一个新的突变。A896G位于DIO2基因3’侧翼区,波尔山羊与萨能奶山羊在此位点为基因型极端分布品种,该位点是否与季节性相关值得深入研究。 克隆获得山羊RFRP基因DNA序列4862bp,包含了一个591bp长度的CDS区,编码196个氨基酸。山羊RFRP预测蛋白与其他物种该蛋白具有高度同源性,并含有一条21个氨基酸残基的信号肽,RFRP前体为分泌型蛋白。RFRP基因5’调控区存在两个突变位点:A712G和T1493C,外显子2存在一个多态位点(A3438T);研究发现三个多态位点基因型分布与繁殖季节性没有显著关系。本研究发现712位点G等位基因频率与平均日照时数呈显著的正相关关系,表明RFRP基因可能受到光照周期的长期自然选择作用,提示RFRP基因712位点可能与山羊繁殖季节性有着间接关系。不过,研究发现RFRP基因多态性与济宁青山羊产羔数不存在显著的相关关系。


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