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水稻分蘖调控基因TE的功能分析和类病变突变体lms1的图位克隆

王丹  
【摘要】:本文主要包括两个研究课题,即水稻分蘖调控基因TE的功能分析和类病变突变体lms1的图位克隆。分蘖是影响水稻形态建成和作物产量的一个重要农艺性状,其发育过程受多个遗传途径的调控。本研究以水稻多分蘖突变体te(tiller enhancer)为材料,分离并鉴定了一个水稻分蘖的关键调控因子TE,通过对其功能的深入研究,揭示了水稻分枝(蘖)调控的一个新机制。类病变突变体中的局部细胞坏死是一种自发的程序性细胞死亡,本研究以一个扩展型全生育期的水稻类病变突变体lms1(lesion mimic and senilism1)为材料,通过图位克隆的方法分离到目标基因LMS1,该基因编码植物LOX-HPL代谢途径中的脂氢过氧化物裂解酶(OsHPL3),其功能缺失能够导致水稻类病变坏死的发生。本文主要研究结果如下: 1、和野生型相比,te突变体分蘖显著增多,并且从分蘖期到灌浆期都保持着旺盛的分蘖能力。此外,te突变体植株矮化,节间缩短;剑叶和穗子短小扭曲;结实率低。组织学观察显示突变体植株矮化、剑叶短小是由细胞数目减少造成的。 2、本课题的前期研究已经将水稻TE基因定位于3号染色体短臂上23kb的区段内,其中基因LOC-Os03g03150的第一个外显子上有2个碱基的差异,一个是ATG后面38-C的缺失,另一个是40-C替换成40-G。我们通过基因组互补实验证实了该基因就是目标基因;mRNA组织原位杂交和TE启动子调控的各组织GUS活性检测表明,TE主要在细胞分裂活跃的组织表达,包括顶端分生组织、腋生分生组织、根原基、腋芽、幼叶和维管束等部位;TE-GFP融合蛋白主要在拟南芥原生质体的细胞核中表达。 3、系统发育分析表明TE是Cdh1在水稻中的同源基因,而Cdh1是泛素E3连接酶APC/C的底物特异性共激活因子,其主要功能是调控细胞有丝分裂的退出和G1期的维持。将TE在裂殖酵母中过表达以后能够抑制酵母细胞的正常分裂。流式细胞仪分析显示te突变体剑叶中25%的细胞具有4C的DNA含量;同时剑叶横切面的DAPI染色也显示部分细胞具有双核,说明TE的功能缺失导致突变体中细胞有丝分裂的退出受阻,使细胞停留在有丝分裂的后期。以上结果验证了TE编码一个Cdh1的同源蛋白,具有保守的细胞周期调控功能。 4、MOC1是水稻分枝调控的关键因子,其蛋白N端有一个保守的D-box结构域,正是Cdh1的识别靶位点。BiFC荧光互补实验显示TE和MOC1存在物理上的相互作用。此外,TE过表达转基因植株的分蘖数有不同程度的减少,Western blot检测显示过表达株系中MOC1含量低于野生型,说明水稻中TE的表达量与MOC1的积累呈负相关,通过以上结果,我们初步证明TE是水稻分蘖的一个关键负调控因子,通过介导MOC1的泛素化降解来抑制分蘖芽的发生和伸长,从而调控植物的胚后分枝发育过程。 5、水稻类病变突变体lms1通常从三到四叶期开始,叶片上会逐渐出现白色不透明的斑点,并逐渐扩展至整张叶片,造成叶片的提前衰老死亡。DAB和台盼蓝染色显示突变体叶片的类病变坏死属于程序性细胞死亡,并伴随有活性氧的积累;苯胺蓝染色显示叶肉细胞中有大量胼胝堆积;叶片遮光实验显示突变体中的细胞死亡受光照强度诱导。 6、遗传分析显示lms1突变体是个单基因隐性突变体;利用“突变体×9311”的F2和F3群体中2912个隐性单株将目标基因定位在2号染色体短臂端的55Kb区间内,包含8个开放阅读框,测序发现ORF7(LOC_Os02g02000)在编码区509个核苷酸后面插入一个1896bp的片段,导致基因LMS1的功能缺失。转基因互补实验也证明突变体的类病变表型是由于LMS1的插入失活引起的。 7、蛋白序列比对发现LMS1编码脂氢过氧化物裂解酶(OsHPL3),是脂氧合酶(LOX)途径下游的一个重要分支途径的关键起始酶,能够特异性催化亚麻酸过氧化物13-HPOT的裂解反应,生成挥发性的(Z)-3-己烯醛及其衍生物(即绿叶挥发物质,GLVs)和不挥发的C12羰基酸。GC-MS分析发现lms1突变体叶片中几乎检测不到C6挥发物((E)-2-己烯醛和(Z)-3-己烯醇)的存在,说明在水稻叶片的LOX-HPL代谢途径中发挥作用的主要是OsHPL3。 8、lms1突变体开花期剑叶中过氧化脂质的含量显著升高,是野生型的5.3倍,我们推测LMS1的功能缺失可能会导致叶片细胞中缺乏相应的脂氢过氧化物裂解酶(13-HPL)来降解上游脂氧合酶(LOX)的代谢产物,造成植物体内亚麻酸过氧化物13-HPOT的大量积累,导致叶片中过氧化总脂含量的显著增加,从而诱发叶片类病变坏死的发生。


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