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高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒分离鉴定、遗传变异及致病性分析

冷雪  
【摘要】:猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一种以仔猪和育成猪呼吸道疾病和母猪繁殖障碍为主要特征的猪的主要传染病之一。自2006年以来,由该病毒变异株引起的高致病性猪繁殖与呼吸综合征(Highly pathogenic porcine reproductive andrespiratory syndrome,HP-PRRS)在我国广泛流行,给养猪业带来了巨大的经济损失。本文从HP-PRRSV的分离鉴定、分子遗传变异和致病性等方面进行了研究和探讨。 2006年至2010年从我国北方部分省市疑似高热病的病死猪采集病料,在Marc-145细胞上进行病毒分离。病料接种Marc-145细胞后,盲传1代即观察到细胞病变,分离毒株对Marc-145细胞表现强嗜性。经Marc-145细胞共分离到6株病毒,对分离的6株病毒分别进行间接免疫荧光染色试验、中和试验及RT-PCR检验,结果表明分离的6株病毒均为美洲型PRRSV,分别命名为PRRSV TJ株、NM1株、HLJ1株、JL1株、JL2株和LN株。并应用TJ株病毒对猪进行致病性研究,结果表明TJ株病毒对猪具有高致病性,成功建立了TJ株病毒对60d龄猪的人工感染模型。 根据VR-2332株全基因序列分段设计引物,分别扩增实验室分离鉴定的6个PRRSV分离株全基因序列,经生物公司测序获得6个分离株全长基因组。结果表明6个PRRSV分离株全长均为15320bp(不包括poly(A)尾),与JXA1和HUN4等HP-PRRSV株全长及各片段长度完全一致。将分离株与GenBank中发表的典型毒株的基因序列进行比对,结果显示,6个PRRSV分离株与美洲型毒株的亲缘关系较近,与2006年以后国内分离的HP-PRRSV毒株同源性最高,核苷酸同源性保持在98.0%以上,且在nsp2区段第481位及533~561位均出现不连续30个氨基酸的缺失。 HP-PRRSV TJ株经Marc-145细胞连续传代致弱,每5~10代进行噬斑克隆纯化病毒。选择致弱过程中不同代次病毒接种猪进行病毒致病性检验,结果表明,TJ株经Marc-145细胞传至第19代后对仔猪的致病性明显降低。对TJ株致弱过程中不同代次病毒(F19、F46、F78和F92)全基因序列分析结果表明,至F92共有48个氨基酸发生变异,各代次新出现的突变氨基酸的个数分别为31个(64.6%)、7个(14.6%)、7个(14.6%)和3个(6.3%),且从F19开始nsp2出现连续120个氨基酸的缺失,该缺失至F92稳定存在。因此推测,TJ株F19代出现的分布于nsp1β,nsp2~nsp5,nsp7,nsp9,nsp10,GP4和GP5的31个氨基酸的突变和nsp2出现的120个氨基酸的缺失对TJ株的致弱起到了重要作用。 为进一步检验TJM致弱疫苗株对猪的安全性,将该毒株经猪体内连续5次传代。至第5代(P5)后病毒接种猪体温正常,未见任何临床异常,肺脏剖检正常,但病毒血症水平有所提高,说明TJM株经猪体内连续传代后在猪体内的适应性增强,病毒复制能力提高。对P5代分离病毒进行全基因序列测定,结果表明,TJM株nsp2存在的连续120个氨基酸的缺失至P5代仍然存在,说明该缺失可在猪体内稳定遗传。P5代病毒与TJM株相比病毒基因组编码的20个蛋白有21个氨基酸发生突变,其中有14个为回复突变,位于病毒基因组的非结构蛋白nsp2、nsp3和nsp9以及结构蛋白GP3、GP4和GP5,推测这14个位点的氨基酸可能与病毒在猪体内的复制能力相关。


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