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水稻白叶枯病菌c-di-GMP信号途径相关基因的功能鉴定及其毒性调控机理的分析

杨凤环  
【摘要】:水稻白叶枯病是由水稻黄单胞水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv. oryzae,简称Xoo)引起的世界水稻生产上重要的细菌病害之一,其致病性及其调控机理的解析将有助于病害的有效控制。由于经济上的重要性以及遗传可操作性,水稻-Xoo的互作已经成为植物-病原物分子互作的研究模式系统之一。随着KACC10331、MAFF311018、PXO99A3个菌株全基因组测序工作的陆续完成,为深入研究Xoo的致病分子机理奠定了基础。 c-di-GMP是一种广泛存在于细菌中的新型第二信使,调控着毒性、生物膜形成、运动性等诸多方面的生物学功能。GGDEF结构域的鸟苷酸环化酶(DGC)控制c-di-GMP的合成,而EAL或HD-GYP结构域的磷酸二酯酶(PDE)控制其降解,这些蛋白在很多细菌的基因组中广泛存在,形成一个复杂的调控网络。通过生物信息学分析发现,在Xoo中存在26个c-di-GMP代谢相关蛋白;研究发现,其中PdeR、RpfG、VieA等基因参与调控Xoo EPS产生和致病性等生物学过程。然而,对于c-di-GMP信号系统在Xoo中的上下游调控体系及作用机理等还未知。本研究旨在更深一步揭示Xoo c-di-GMP信号途径,为进一步解析Xoo的致病分子机理提供科学依据。 1.双组份调控系统PdeK/PdeR调控c-di-GMP的代谢和Xoo毒性 双组份调控系统是细菌中主要的感应-调节机制,典型的TCS包括组氨酸激酶(HK)和反应调控蛋白(RR),对感应外界的信号和调控细胞功能起到了关键的作用,其中一类RR包含c-di-GMP信号相关结构域作为输出结构域,接受来自上游的磷酸化信号后激活其活性。 PdeR(PXO_01019)是带有c-di-GMP代谢相关结构域GGDEF,EAL及磷酸化信号接收结构域REC的RR,调控EPS产生和致病性,在其两侧具有两个组氨酸激酶蛋白PdeK(PXO_01018)和PXO_01020。为了对PdeR的功能更深入的了解,首先原核表达了PdeR全长和不同结构域蛋白,显色法和HPLC分析包含GGDEF和EAL结构域的PdeRGE具有的PDE活性。采用同源重组的方法,构建了PdeK和PXO_01020的突变体,发现与野生型相比,PdeK缺失突变后致病性明显的降低, PdeK胞外多糖的产生也有所减少,但是PXO_01020相对于野生型表型没有明显的变化。RT-qPCR结果显示,在PdeR与PdeK中EPS合成相关各基因gumMBKD和T3SS系统的相关基因hrpG,hrpX和hpa1的表达表达明显降低了,说明这些基因受PdeR和PdeK正调控。在酵母双杂交试验中,发现PdeR与PdeK具有较强的相互作用,这种作用依赖于PdeR的REC和EAL结构域,而PdeR与PXO_01020没有发现互作;当PdeK蛋白磷酸化后,与PdeR进行反应,激活了PdeR全长蛋白的PDE活性。总之,PdeK (HK)/PdeR(RR)组成一对双组分系统、调控c-di-GMP的代谢和水稻白叶枯病菌的毒性。 2. c-di-GMP受体蛋白PXO_00403调控Xoo毒性和HR c-di-GMP受体作为c-di-GMP信号的下游调控机制,与c-di-GMP直接结合或调控下游目标基因的表达,从而调控细胞功能。PliZ结构域蛋白、转录调控因子FleQ和Clp、mRNA生物开关等可以与c-di-GMP结合,此外一些退化的GGDEF或EAL也作为c-di-GMP受体发挥功能。这些受体的存在说明c-di-GMP在基因转录、翻译和翻译后不同的水平调控细菌细胞的生物过程。 PXO_00403,包含c-di-GMP代谢相关结构域GGDEF和EAL,PXO_00403突变后Xoo致病力明显的下降,而且在非寄主烟草上引起的过敏性反应有所延迟。RT-qPCR分析T3SS相关基因hrpG,hrpX和hpa1在PXO_00403中成下调表达。通过生物信息学分析、酶活试验和ITC试验发现,PXO_00403的GGDEF结构域和EAL结构域退化并不具有活性,而是与c-di-GMP以1:1比例结合,说明PXO_00403在Xoo中以c-di-GMP受体来调控细菌的致病性和HR。 3. GGDEF结构域蛋白PXO_00649和PXO_02615功能鉴定 PXO_02615和PXO_00649只包含c-di-GMP合成相关结构域GGDEF,本研究对PXO_02615和PXO_00649基因的功能进行了初步的研究。采用标记置换法构建了基因突变体,发现PXO_02615突变后EPS产生较野生型增加了20%,PXO_00649突变后,EPS产生及致病力有一定程度的增强,而运动性、生物膜、胞外酶等没有变化。结果说明,PXO_02615和PXO_00649参与调控了Xoo的致病性和EPS的产生,对于PXO_02615和PXO_00649是否是通过影响c-di-GMP的浓度而发挥作用,需要进一步研究。 总之,本研究揭示了水稻白叶枯病菌c-di-GMP信号途径的上游受磷酸化信号的影响,下游通过与受体分子的结合,调控毒性基因的表达从而影响毒性,为进一步了解c-di-GMP调控网络及Xoo的致病机理提供了科学依据。


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