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降解毒死蜱的副球菌TRP菌株基因组测序、cpd基因的克隆及功能验证

李康  
【摘要】:筛选分离毒死蜱(chlorpyrifos,CP)降解微生物解决毒死蜱农药残留给水体和土壤环境带来的污染问题是一个可行的生物修复技术,对于研究农药残留的生物降解具有重要意义。副球菌(Paracoccus sp.)TRP是一株对毒死蜱具有很强降解能力的菌株。本论文以其为研究对象,研究了菌株的基本特性,经多种基因克隆方法相结合获得一个新的毒死蜱降解酶基因,并研究了毒死蜱降解酶结构与功能的关系,研究内容如下: 对本实验室筛选的TRP菌株进行复壮,菌株在第2天到第4天对CP的降解最快,到第7天对50mg/L CP的降解率可达83.3%。菌株对5~100μg/mL Amp具有抗性;对5~100μg/mL Tc及Gm不具有抗性。菌株不能够产生糖脂类阴离子生物表面活性剂。菌株组成型表达毒死蜱降解酶。 采用Solexa测序技术测定了副球菌TRP的基因组序列(GenBank登录号AEPN00000000)。基因组大小约为3.9Mb,GC含量62.89%。预测所得CDS数为3961个。共得到155个代谢图,其中25个与异源物质代谢有关,包括除草剂阿特拉津代谢图和脱氮代谢图。在基因组序列上找到96个串联重复区域,200个转座子,147个IS,45个tRNA和5套rRNA。副球菌TRP与Paracoccusdenitrificans Pd1222在进化上关系较近,大部分基因的同源性较高。在副球菌TRP菌株中鉴定了与P. denitrificans Pd1222中类似的脱氮作用所需的所有四个氧化还原酶类基因。TRP菌株基因组的分析有助于鉴定多种不同的降解基因,进一步阐明微生物降解毒死蜱代谢途径。这是迄今为止关于毒死蜱降解副球菌菌株的基因组测序的首次报道。 从副球菌TRP中克隆得到了毒死蜱降解基因cpd,基因全长927bp,GC含量60.73%。cpd基因与目前已发表的有机磷降解酶基因的同源性较低,是一个新的有机磷降解酶基因。CPD蛋白由308个氨基酸残基构成,分子量为33.8kDa。带电量为-7.0。等电点为4.8305。CPD蛋白是酯酶_脂酶超家族的成员之一,不仅具有Ser155-Asp251-His281催化三联体和模序GDSAG,还具有酯酶保守的底物结合口袋ILYIHGGGWSFCSA。在E.coli BL21(DE3)中表达的CPD融合蛋白大小约为53.9KDa,具有酯酶活性。CPD蛋白在行使酯酶功能时,不需要金属离子;1mmol/L PMSF、1mmol/L DEPC和0.025%SDS显著抑制其酯酶活力,0.025%Tween-20显著增强其酯酶活力;CPD蛋白行使酯酶功能时需要Ser和His。在15min内CPD酶液对50mg/L CP的降解率为63.5%±2.14。酶活力为59.62U/mg。将四环素Tc盒插入TRP菌株cpd基因中成功构建cpd基因敲除的TRP△cpd菌株。5天内,菌株TRP△cpd和TRP对50mg/L CP的降解率分别为27.3%和78.5%。TRP△cpd菌株对CP的降解率显著降低,说明cpd基因在菌株TRP对毒死蜱的降解中起到主要作用。 CPD蛋白的三级结构是由α螺旋、β折叠及无规卷曲高度折叠形成的紧密的球状结构。活性位点Ser155,Asp251和His281均位于β折叠链和α螺旋之间柔韧性较强的loop区域。CPD与CP分子对接表明: Ser155的侧链羟基O原子与CP结构中P原子的空间距离较近,易于发生亲核攻击,将CP降解为TCP和DETP。通过PCR技术将Ser155突变为Ala(S155A)。15min内,CPD-S155A酶液对50mg/L CP的降解率为5.15%±1.03,酶活力为7.85U/mg。Ser155突变为Ala后,CPD蛋白对CP的降解率下降10余倍,说明Ser155在CPD对CP的降解中起到关键作用。


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