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Ⅰ型普鲁兰酶产业菌的筛选及其基因克隆、分子改造和高密度发酵表达研究

乔宇  
【摘要】:普鲁兰酶(pullulanase,EC3.2.1.1/41)是一类淀粉脱支酶,能够专一性切开支链淀粉分支点中的α-1,6糖苷键,切下整个分支结构,形成直链淀粉。普鲁兰酶能分解支链淀粉的特性决定了它在淀粉加工相关工业中的广泛应用,已成为淀粉酶制剂中一个很有前途的新品种。 将普鲁兰酶作为饲料添加剂应用于动物养殖中具有广阔的应用前景。首先普鲁兰酶能消除饲料原料中支链淀粉所形成的抗营养因子,同时与动物内源和外源淀粉酶协同作用,有效地促进动物对饲料中的营养物质的消化吸收,提高饲料利用率,提高动物的抗病能力。本论文以筛选饲用普鲁兰酶为目标,筛选普鲁兰酶产生菌,克隆、表达普鲁兰酶基因和高密度发酵生产普鲁兰酶。主要研究工作如下: 1利用平板涂布法从淀粉加工厂附近土壤中分离到一株产普鲁兰酶的细菌H4,通过形态学、生理生化试验及16S rDNA分类鉴定,确定该细菌为一株微小杆菌(Exiguobacterium sp. H4)。对筛选到的菌株培养基成分及产酶条件进行了优化,在优化条件下,发酵72h后胞外产生普鲁兰酶的活力可达6.35U/mL,比复筛的产量3.02U/mL提高了110.2%。 2根据普鲁兰酶蛋白序列保守区,利用CODEHOP法设计简并引物并克隆得到了来源于Exiguobacterium sp. H4的普鲁兰酶部分编码基因。利用TAIL-PCR获得了基因全长序列,Genbank登录号:JQ686229。通过生物信息学分析,该酶为I型普鲁兰酶,属糖苷水解酶13家族。 3将Exiguobacterium sp. H4原始普鲁兰酶基因和改造普鲁兰酶基因在大肠杆菌中进行了表达。构建了6个大肠杆菌表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS,6个不同的重组普鲁兰酶在大肠杆菌宿主中均有表达。重组普鲁兰酶酶活力最高为N端缺失100个氨基酸残基的重组普鲁兰酶(ExPulA1R),研究了该酶的酶学性质。重组普鲁兰酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH为6.0;对金属离子和化学试剂有较强的抗性,Co~(2+)对酶活力有较明显的激活作用;该酶作用于含有α-1,6-糖苷键的底物普鲁兰糖、可溶性淀粉和支链淀粉;酶解普鲁兰糖产物主要是麦芽三糖、麦芽糖和葡萄糖等的混合物。重组普鲁兰酶能够抗胃蛋白酶和胰蛋白酶的水解。 4在摇瓶培养的基础上,建立了大肠杆菌工程菌产普鲁兰酶的高密度发酵工艺。重组大肠杆菌的高密度发酵使用合成培养基,补料阶段采用指数流加的工艺,在设定细胞的比生长速率为0.12的前提下,限制补料中碳源的供应,有效阻止乙酸的产生。当细胞密度OD_(600)达到70.0开始诱导,最终细胞干重为53.3mg/mL,普鲁兰酶活力达到67.0U/mL。 本研究首次报道微小杆菌属细菌产普鲁兰酶,以这株微小杆菌基因组为模板克隆得到了普鲁兰酶新基因。原始普鲁兰酶基因和改造普鲁兰酶基因在大肠杆菌中获得了稳定的表达。在国内首次建立了基于重组大肠杆菌葡萄糖产出系数的指数流加高密度发酵工艺,对普鲁兰酶的工业化生产具有指导意义。


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