沙冬青温度相关基因表达谱分析及冷诱导基因AmDUF1517的克隆与功能研究

【摘要】：温度是影响植物生长发育的重要环境因子之一，也是影响农作物产量的重要因素之一。沙冬青是我国温带荒漠的常绿灌木，在长期的逆境适应中形成了独特的耐受机理，具有抗旱、抗寒、耐高温、抗贫瘠等优良性状，是开展植物抗逆研究的理想材料。本文以蒙古沙冬青为材料，在已建立的沙冬青逆境转录表达谱的基础上，筛选与温度相关基因并进行功能鉴定研究，旨在为抗性育种提供新的基因资源。取得以下进展： 1.对沙冬青温度诱导表达谱进行了验证，筛选了温度相关基因。对已经建立的沙冬青温度相关转录表达谱进行生物信息学分析，挑选温度相关上调表达的基因片段（Transcript DerivedFragments，TDFs），从中选择43条温度诱导表达TDFs开展表达谱分析验证。共确定温度诱导表达TDFs16条：其中2条TDFs与信号转导相关，3条与细胞代谢相关，4条与光合和能量相关，2条与转录表达调控相关，1条与细胞逆境防御相关，4条功能未知。克隆获得其中3个基因的全长cDNA序列，通过与GenBank已知序列比对，参考其各自相似性高的序列分别命名为AmRubiscoActivase、AmDUF1517和class II small AmHSP。选择冷诱导基因AmDUF1517为进一步研究的目标基因。 2.对AmDUF1517基因特征分析表明：AmDUF1517开放阅读框906bp，编码301个氨基酸，其C-端与拟南芥的DUF1517保守区域（DUF1517superfamily）氨基酸序列高度同源，基因内含有一个969bp的内含子。染色体步移技术克隆得到长度约1.0kp的AmDUF1517启动子序列，生物信息学分析明确转录起始位点上游-127bp到-78bp处有典型真核生物启动子序列特征，TATAbox在启动子上游约-50bp处，明确了AmDUF1517基因的序列特征并有效验证基因序列全长的完整性。利用Southern印记杂交技术，初步确定AmDUF1517基因在沙冬青基因组中为单一拷贝。亚细胞定位发现AmDUF1517定位在叶绿体上。实时荧光定量PCR发现AmDUF1517在低温4℃处理后，表达量上升，在处理初期，表达量曲线出现两个高峰。分别用乙烯、NaCl、脱落酸、抗坏血酸、赤霉素、水杨酸和茉莉酸甲酯处理沙冬青幼苗，发现乙烯、水杨酸和赤霉素能使AmDUF1517的表达量与对照相比提高到2倍或以上，NaCl提高到2.5倍。 3.过量表达AmDUF1517基因的拟南芥和拟南芥DUF1517突变体回复实验初步验证了AmDUF1517基因功能。构建植物表达载体转化野生型拟南芥和拟南芥DUF1517突变体，获得突变体351、353、357和361的转基因株系，以及野生型拟南芥的转基因植株系。分别测定4℃2h前后各拟南芥株系的电解质渗漏率、游离脯氨酸含量、可溶性糖含量和丙二醛含量，发现除了回复突变体351-AmDUF1517的各项生理指标与其对应的突变体一致，其他回复突变体植株均发生了显著变化，均表现出对冷胁迫的抗性显著增加。野生型拟南芥，从可溶性糖和游离脯氨酸含量上表现出其转基因株系的抗性增强，其他生理指标没有表现出其转基因株系抗性的变化。 4.盐胁迫和干旱胁迫下比较拟南芥的发芽率，发现同种处理下野生型、过表达型、突变体和回复突变体之间没有显著差异。-20℃冷胁迫2h后一周恢复实验发现，3d（冷处理时）拟南芥幼苗冷胁迫后，突变体根长显著短于野生型、过表达型和回复突变体，而10d拟南芥幼苗的根长之间没有显著差异，但是突变体的须根系较其他三种株系显著增加，突变体有些叶片出现失绿现象。这些结果说明突变体的抗寒力低于其他三种拟南芥株系。通过拟南芥叶片原生质体抗寒实验（-20℃2h），发现与野生型和突变体相比，外源基因AmDUF1517提高了过表达型和回复突变体叶绿体膜结构的稳定性。