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介壳虫类昆虫DNA条形码识别技术研究

田虎  
【摘要】:蚧总科(Hemiptera: Coccoidea)昆虫统称介壳虫,据ScaleNet统计全世界目前已知约有48科1050属7500多种介壳虫,除少部分为资源昆虫外,多为农林业中发生较普遍且为害严重的经济害虫。介壳虫类昆虫具有形态多样,适应性强等特点,同时还能传播病毒,诱发煤污病等问题,快速准确的鉴定是有效防治介壳虫类害虫的必要前提。然而,长期以来,基于形态特征的介壳虫类昆虫的鉴定识别研究常遇到各种复杂的情况,如:幼期(包括卵、幼虫/若虫、蛹),隐存种、复合种和样本受损等,导致快速准确鉴定相当困难。本研究针对介壳虫类昆虫种类多,难以进行快速准确识别的问题,利用DNA条形码技术,以来自全国不同采集地点的介壳虫类昆虫的线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)细胞色素C氧化酶亚基I的基因(cytochrome c oxidase subunit1, COI)为靶标,探讨该技术在介壳虫种类识别鉴定中的应用,构建介壳虫DNA条形码鉴定系统,并结合DNA条形码研究结果研发重大入侵害虫扶桑绵粉蚧的种特异性引物及SS-COI检测技术,具体研究结果如下: (1)介壳虫类昆虫DNA条形码识别技术研究。利用蚧总科通用型引物PcoF1/LepR1,以来自全国7个省12个不同采集区域的21种介壳虫为靶标,扩增其mtDNA COI基因并进行碱基测序,对测序成功的序列校对后进行多重比对分析,以邻接法(NJ法)构建系统发育树,并以Kimura双参数模型(Kimur-2-Parameter, K2P)计算种内、种间遗传距离。结果显示:来自于3科18属21种的介壳虫在进化树上可以聚类形成明显的三大支系,同一物种不同种类介壳虫最初分支自展值均为100%;多数介壳虫COI基因序列的GC含量都很低,平均仅为18.25%;种间平均遗传距离(27.94%)为种内平均遗传距离(0.14%)的199.6倍,且种内、种间遗传距离没有重叠;表明DNA条形码技术完全可以满足对介壳虫类昆虫快速准确鉴别的应用需求。 (2)介壳虫类昆虫DNA条形码数据库的构建。该系统包括标本库、知识信息库和DNA条形码序列库。标本库主要包括实物标本和DNA样本,实物标本主要包括寄主植物、标本编码、采集人及经纬度、海拔高度、采集地点等信息,DNA样本于-20oC保存。目前标本库共收录6科24属30种介壳虫的标本信息,DNA样本共6科24属30种179份。知识信息库主要包括物种中文名称、拉丁学名、形态特征、生物学特性、主要危害、寄主植物、国内外分布、防治措施等。知识库中现已录入6科24属29种介壳虫种类的相关信息。条形码序列库共收录了8科29属40种介壳虫共437条COI序列,一方面来源于本实验(6科24属30种154条)研究所获序列,另一方面来源于BOLD (8科25属35种283条)数据库中已公开的序列。介壳虫类昆虫DNA条形码识别系统具有COI条形码序列识别、序列查询、序列提交和我的序列等功能模块。目前该系统可对40种介壳虫类昆虫进行鉴定识别,其中本数据库独享种类5种,本数据库的构建对实现介壳虫类害虫的远程检测和实时监测具有重要意义。 (3)扶桑绵粉蚧的种特异性引物及其SS-COI检测技术。根据数据库中已知的3种粉蚧科昆虫的COI序列设计通用型引物,成功地扩增出了扶桑绵粉蚧以及其他7种我国常见粉蚧的5’端COI基因片段,然后根据测序结果并结合数据库中已有3种粉蚧的相关碱基序列,设计了1对扶桑绵粉蚧特异性SS-COI引物PSZTF1/PSZTR1。种特异性检验结果显示,该SS-COI引物只对扶桑绵粉蚧具有扩增效果,对常见的其他粉蚧科害虫如康氏粉蚧、南洋臀纹粉蚧、木槿曼粉蚧、甘蔗红粉蚧、新菠萝灰粉蚧、番石榴粉蚧等以及同属近缘种石蒜绵粉蚧不具有扩增能力;而且,对采自我国7个省市14个不同区域的扶桑绵粉蚧和不同虫态的扶桑绵粉蚧,以及口岸截获的来自巴基斯坦的扶桑绵粉蚧等具有同样的检测效果;表明,该SS-COI检测技术体系完全可用于口岸检疫,以及蔬菜、花卉及其种苗调运中扶桑绵粉蚧的检测及其扩张趋势和发生危害监测。 本实验围绕介壳虫类昆虫开展分子检测识别技术研究,构建了介壳虫DNA条形码识别系统,为口岸检疫以及蔬菜、花卉、种苗调运过程中介壳虫类害虫的准确快速鉴定提供了技术支持,为介壳虫类害虫的远程检测和有效监测提供基础服务平台。通过设计种特异性引物构建的重大入侵害虫扶桑绵粉蚧快速分子检测技术体系,为其快速检测与准确识别提供了依据,为有效阻截扶桑绵粉蚧在我国的进一步传播扩散和危害提供了技术支撑。


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