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山葡萄及其杂种Myb相关基因的分析

付晓伟  
【摘要】:本试验针对山葡萄多糖多酚含量丰富的特点,对其基因组DNA提取方法进行了优化,获得了高质量、高纯度的DNA提取方法,以保证后续试验的准确。通过对两性花山葡萄株系、单性花山葡萄株系及山欧杂种品种调控花色苷合成的Myb相关基因的研究,来鉴定山葡萄Myb相关基因的基因型,丰富对Myb基因的研究,确定具体调节山葡萄花色苷合成的Myb相关基因。通过对山葡萄及其杂种VvmybA1基因片段的对比及SNP相关分析来确定试验材料的遗传多样性,更好的进行山葡萄的鉴定及分类工作。本实验还从分子水平推测两性花山葡萄‘双庆’应该是山葡萄种内变异产生的。本研究的主要研究结果如下: 1.改良CTAB法提取山葡萄基因组DNA 以5种山葡萄株系及1株欧亚种为试验材料。取相同条件下的幼嫩叶片,用王军等(2000)的CTAB法、试剂盒及改良的CTAB法进行基因组DNA的提取。传统的CTAB法提取的结果,部分存在褐变和不同程度的乳黄色及褐色基因组DNA。用试剂盒提取的DNA含量及纯度过低不可使用。而改良CTAB法的提取结果均为白色,纯度及质量检测结果显示,改良CTAB法提取的DNA含量明显提高,OD260/OD280在1.8~1.95之间,优于传统的CTAB法。并且,琼脂糖凝胶检测显示,传统的CTAB法提取的基因组DNA完整性被破坏,杂质较多。而改良的CTAB法提取的DNA完整性及纯度均较好。高质量的DNA为后续的试验奠定了良好的基础。 2.山葡萄Myb相关基因的基因型的确定 以10个单性花山葡萄品种(株系)、3个两性花山葡萄品种(株系)、7个山欧杂种品种为材料,用欧美杂种品种‘巨峰’及欧亚种‘黑比诺’作参照,对调控花色苷合成的多个Myb转录因子的基因型进行鉴定。结果显示,欧亚种‘黑比诺’、欧美杂交种‘巨峰’和山欧杂种‘北玫’和‘北方’中有VvmybA1a基因;山欧杂种‘北红’中有VvmybA1和VvmybA3基因;山欧杂种‘北醇’、‘北玫’、‘北方’和‘公酿一号’中有VvmybA1、VvmybA2和VvmybA3基因。山欧杂种‘左红一’和‘左优红’中存在VvmybA1和VlMybA2基因。山葡萄中只有VvmybA1基因,两性花山葡萄与单性花山葡萄在Myb相关基因的基因型上具有一致性。说明山葡萄花色苷的产生可能只是VvmybA1基因调控的,山葡萄两性花株系不存在欧亚种的特征基因,两性花性状推测是山葡萄种内变异产生的。而山欧杂种可能因杂交的原因,染色体重组,使Myb相关基因基因型具有较大的差异,出现多种Myb相关基因的基因型。 3.山葡萄VvmybA1基因片段SNP的检测与分析 通过对19个试验材料VvmybA1基因片段的克隆和序列测定得到967bp长的基因片段。通过序列比对发现,19个供试样品的该核酸序列相似度达98%以上,在非编码区三个试验样本存在2种不同序列片段的缺失。共检测到23个SNP位点,使15处氨基酸发生了改变,定义了14个单倍型。SNP分析得出较高水平的单倍型多样性指数Hd=0.965和单核苷酸多样性指数Pi=0.00897。 中性检测的结果显示,山葡萄株系之间达到了基因漂变和选择性中性突变间的平衡,该基因保持相对的稳定。而山欧杂种因为杂交而使该基因发生了改变,使其具有更高的多样性。进化树图显示出山葡萄与山欧杂种之间的部分基因重叠,并且两性山葡萄株系‘双庆’与‘双优’处于一小个分枝,与多个山葡萄分属一个大分枝,说明他们具有更近的亲缘关系。‘双丰’与另一部分山葡萄单性株系分到一组。说明山葡萄两性花株系与山葡萄单性花株系具有很近的亲缘关系。


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