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鸡NK细胞的分离鉴定及靶细胞筛选

杨超  
【摘要】:自然杀伤(Natural killer, NK)细胞是一类重要的淋巴细胞,在抗病毒和疾病的遗传抗性中具有重要作用。然而,至今,对NK细胞的认识大多来源于小鼠和人类,并不清楚这些认识是否适用于其他动物。鸡是非哺乳动物中禽类的代表动物,至今对鸡NK细胞了解不多。已有的证据表明,鸡NK细胞与哺乳动物NK细胞差异巨大。由于缺乏特异性抗体,14日龄鸡胚脾脏是鸡NK细胞的主要来源,并主要根据形态学和功能学进行鉴定。鸡NK细胞在多种疾病中具有重要作用,而BNK等C型凝结素基因在鸡主要相容性复合体(Major histocompatibility complex, MHC)和NK细胞中的发现暗示鸡NK细胞可能在疾病的遗传抗性中扮演重要角色。 本研究利用实验室建立的SPF B19和B21MHC单倍型鸡,收集14日龄鸡胚新鲜脾脏,并用冷胰酶消化法分离收获淋巴细胞,并在添加条件培养基和鸡重组IL-2的完全培养基中培养48h后,收获悬浮细胞,既为鸡NK细胞。流式前向角和侧向角分析显示培养的细胞中85.1%的细胞大小均一,颗粒度一致;瑞氏吉姆萨染料染色结果表明收获的细胞内一侧含有嗜酸性大颗粒,符合鸡NK细胞的形态特征;流式细胞术单克隆抗体染色结果显示,TCR0细胞中,97.4%高表达MHC Ⅰ类分子,30.8%低表达CD8a,不表达T细胞表面标记CD3和B细胞表面标记CD4和Bu-1,符合鸡NK细胞表面标记特点。本研究首次在国内成功分离并纯化了鸡NK细胞。 本研究建立了流式细胞术检测鸡NK细胞细胞杀伤活性的方法,并分别检测了鸡NK细胞对小鼠NK细胞靶细胞YAC-1和人NK细胞靶细胞K562的特异性杀伤能力,结果表明YAC-1对鸡NK细胞的细胞杀伤敏感,而K562不敏感。该结果证明哺乳动物细胞系可以作为鸡NK细胞的靶细胞。比较B19和B21MHC单倍型鸡NK细胞对YAC-1的杀伤能力,结果表明B21鸡的NK细胞细胞杀伤活性高于B19鸡NK细胞。推测NK细胞可能在B19与B21单倍型鸡的遗传敏感性与抗性中发挥作用。 进一步研究鸡NK细胞杀伤靶细胞YAC-1的信号途径,可知YAC-1细胞表面表达小鼠MHCI类分子、活化性受体配体RAE-1和H60,但通过抗体阻断鸡NK细胞对这些分子的识别后,不能抑制特异性杀伤活性,暗示鸡NK细胞对靶细胞YAC-1的杀伤可能不是通过识别MHC I类分子或者RAE-1和H60。 我们表达了鸡NK细胞的抑制性受体BNK基因并制备了相关抗体。BNK基因是推测的鸡NK细胞抑制性受体基因,为了分析鸡NK细胞的生物学功能,我们利用原核表达载体pET-30a分别克隆、表达了B19和BB21单倍型鸡的BNK基因,并分别制备了兔抗血清,Western-blot实验结果表明,可以检测到BNK表达的特异性条带,为进一步研究BNK受体的配体和功能以及NK细胞奠定了基础。


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