嗜热微生物来源的葡萄糖苷酶和木糖苷酶性质及功能研究

【摘要】：随着生物质开发利用热潮的掀起，木质纤维素降解酶系中的关键酶如β-葡萄糖苷酶和β-木糖苷酶引起了人们的广泛关注。性质优良的木质纤维素酶应具有好的热稳定性、寡糖耐受性以及与其它酶的协同性，有利于其在工业生产中抵抗不利因素、降低生产成本、减少环境污染。本文以嗜热微生物为材料，从中挖掘新型的嗜热β-葡萄糖苷酶和β-木糖苷酶，为工业应用提供酶学性能优良且成本低廉的糖苷水解酶。 从嗜热真菌Neosartorya fischeri P1中克隆得到一个糖苷水解酶第3家族的β-葡萄糖苷酶基因bgl3P1，在毕赤酵母中重组表达。重组酶Bgl3P1与已报道的嗜热真菌β-葡萄糖苷酶相比具有较高的发酵水平(1,873U/mL)、比活力(2,189U/mg)和最适温度(80°C)，且在70°C、pH3.0-9.0的条件下保持稳定。该酶还具有良好的离子及化学试剂抗性、较高的葡萄糖耐受性(Ki值：13.4mM)和广泛的底物特异性，可以快速高效地降解大豆异黄酮结合型糖苷(5分钟内完全降解)。 从嗜热细菌Alicyclobacillus sp. A4中克隆得到一个糖苷水解酶第3家族的β-葡萄糖苷酶基因bgl3A4，并在大肠杆菌中异源表达。Bgl3A4为中温、中性酶(55°C，pH6.0)，具有良好的金属离子、化学试剂抗性以及高度的寡糖耐受性(Ki值：L-阿拉伯糖，1.32M；木糖，1.04M；半乳糖，110mM；葡萄糖，100mM；甘露糖，30mM)。底物特异性研究表明Bgl3A4是一个葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能酶，其木糖苷酶活性占葡萄糖苷酶活性的96%，远远高于已知的双功能酶。序列比对及同源建模分析发现Bgl3A4的C端与已有晶体报道的酶相比多出84个氨基酸，将其截短后木糖苷酶相对活性下降了93%，说明该序列参与底物的识别与结合。 从嗜热真菌Humicola insolens Y1中获得两个糖苷水解酶第43家族的木糖苷酶/阿拉伯呋喃糖苷酶双功能酶基因(xyl43A和xyl43B)，异源表达并纯化。两个重组酶都是中温、中性酶(50°C，pH5.0–7.0)，有极好的稳定性和金属离子抗性。其中，Xyl43A和Xyl43B可作用于对硝基苯基β-D-木糖苷、对硝基苯基α-L-阿拉伯呋喃糖苷和木聚糖，具有广义上的木糖苷酶/阿拉伯呋喃糖苷酶双功能酶的特性。Xyl43A和Xyl43B有极好的木糖耐受性(Ki值分别为79和292mM)。在木聚糖降解过程中，Xyl43A和Xyl43B可以与同菌株来源的木聚糖酶Xyn11A协同作用,加速木聚糖底物的降解转化，协同效率最高达1.29。 综上所述，本研究从三株嗜热微生物中克隆得到两个糖苷水解酶第3家族的β-葡萄糖苷酶基因、两个43家族的木糖苷酶/阿拉伯呋喃糖苷酶双功能酶基因，并进行了异源表达、蛋白纯化、酶学性质测定及相关应用实验。Bgl3P1具有较高的表达量，高温活性及比活力，能够高效降解大豆异黄酮；Bgl3A4是一种典型的葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能酶，具有广泛的底物特异性；Xyl43A和Xyl43B能够与木聚糖酶协同作用，高效地降解半纤维素物质。这些性质优良的糖苷水解酶在饲料、食品、医药、洗涤剂及能源等行业中将有很好的应用前景。