聚合酶保真性下降导致口蹄疫病毒减毒的研究

【摘要】：口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease, FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus, FMDV)引起的急性、热性传染病,主要侵害猪、牛、羊等偶蹄动物。该病一旦爆发对出口贸易将造成严重的影响,给发病国家和地区带来巨大的经济损失。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须通报的动物疫病。 FMDV属于微RNA病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒属(Aphthovirus)的成员,病毒基因组是由单股正链RNA组成。微RNA病毒基因组编码的3D非结构蛋白为RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp),是病毒复制酶系统的核心成分,与病毒基因编码的一些其他蛋白以及宿主细胞因子一起构成病毒的复制酶系统,在RNA病毒的复制周期中起重要的作用。 由于RdRp缺乏校正功能,使得RNA病毒具有高度异质的准种(quasispecies)特性。已有的研究表明,提高或降低RdRp的保真性可改变RNA病毒种群的遗传多样性和宿主适应性,进而可导致病毒对自然宿主的致病性减弱。因此,依据RdRp的复制保真性对病毒毒力的决定作用,通过改变聚合酶的保真性使RNA病毒的毒力减弱,不但具有重要的理论价值而且具有诱人的疫苗开发前景。 本研究根据FMDV聚合酶的模拟空间结构和生化特性,选取一系列可能影响其活性和保真性的氨基酸残基,利用定点诱变和反向遗传技术构建了39个携带3D聚合酶氨基酸替换的感染性克隆重组质粒,从中拯救出5个复制稳定的FMDV聚合酶突变株(D165E. K172R、K177R、Y241F和G361S)。与亲本株相比,这些突变株对核苷类诱变剂的敏感性更高,提示这些突变株对药物敏感性的升高可能是由于聚合酶保真性降低导致的。进一步的高通量测序分析显示,所有突变株的变异频率均明显升高,证实这些突变株是RdRp低保真性FMDV突变株。另外,与亲本株相比,这些突变株的体外适应性明显降低了。更为重要的是,在乳鼠毒力实验中,5株突变株病毒的毒力都存在不同程度的减弱,其中D165E和K172R突变株的毒力下降程度最大,仅为亲本株毒力的1/10。本研究首次发现,口蹄疫病毒的RdRp保真性降低导致病毒的毒力减弱,其结果不但具有基础病毒学理论价值,也为人工构建FMDV减毒株开辟了新的途径。