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表达鸡传染性喉气管炎病毒gI和gB基因的重组新城疫病毒的研究

孙娜娜  
【摘要】:鸡传染性喉气管炎(Infectious laryngotracheitis,ILT)是由鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)引起的鸡的一种急性、高度接触性呼吸道传染病,是影响世界养禽业的主要传染病之一。目前主要使用修饰过的ILTV活病毒疫苗、以火鸡疱疹病毒(Turkey herpesvirus,HVT)和以痘病毒(Fowlpox virus,FPV)为载体的载体疫苗来预防ILT。然而,ILTV活病毒疫苗在机体传代的过程中可能发生毒力返强,并且导致潜伏感染,而HVT和FPV的活载体疫苗免疫保护效果不如弱毒疫苗有效,因此有必要研发更加有效的疫苗来预防ILT。ILTV基因组为线性双链DNA,大小在150 kb左右,含有76个开放阅读框(Open reading frame,ORF),编码至少11种囊膜糖蛋白,UL27和US7分别编码病毒的糖蛋白gB和gI。gI和gE形成异源二聚体,促进病毒在细胞间的扩散。gB是病毒感染所必须的,参与膜融合、病毒入侵过程。新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的危害养禽业的重大烈性传染病。NDV基因组是不分节段、单股、负链RNA,编码8种蛋白。根据其致病性将NDV分为弱毒株、中等毒力毒株和强毒株。目前,新城疫弱毒株,如La Sota毒株,被广泛用作疫苗来预防NDV,而且弱毒株作为活病毒载体,通过反向遗传操作系统,常用于表达人类和动物其他病毒的外源基因,研制重组病毒作为疫苗或其他生物制品。ILTV LJS09株是从中国江苏省某养殖场分离到的一株强毒株,其全基因组已经被测序。本研究根据GenBank上登录的ILTV LJS09株全基因组(登录号:JX458822)序列,将gB基因分为前后部分重叠的2段,分别设计扩增引物,同时设计扩增gI全长的引物,通过基因克隆技术,将3个基因片段克隆于表达载体PCAGGS中,首先通过酶切分析及序列测定,验证其编码框是否正确,然后将该重组载体进一步用于感染性克隆载体的构建及重组病毒的拯救。本研究用的NDV基因组全长cDNA克隆以pBR322为骨架载体,通过克隆La Sota毒株基因组构建,在NDV cDNA的P和M之间,即基因组的3 165 bp位置有引入Pme I酶切位点,外源基因克隆到此位置。本研究拯救了表达ILTV LJS09株的gI、两个gB基因片段的重组新城疫病毒,分别命名为r La-gI,r La-gBN,r La-gBC。对三个重组病毒救获后进行RT-PCR、间接免疫荧光(IFA)、蛋白免疫印迹(Western Blot),评价重组病毒的遗传稳定性、外源蛋白表达稳定性,结果表明三个外源蛋白基因可稳定存在至少二十代,而且都在重组病毒感染的细胞中得到有效表达。通过测定和比较重组病毒与野毒株La Sota的HA、EID50、MDT,表明重组病毒保持了La Sota疫苗株高滴度的鸡胚生长特及病毒的低致病性。此外,重组病毒的生长动力学曲线与疫苗株相似,在感染后72 h时病毒滴度达到最大。动物免疫攻毒实验表明,三个重组病毒免疫机体后,均可诱导机体产生针对NDV的高水平的抗体,但用ELISA检测不到针对ILTV的抗体;NDV强毒株F48E9攻毒后,免疫组可被完全保护,对照组全部死亡,排毒率明显低于对照组,表明重组病毒的免疫对新城疫强毒的攻击具有良好的保护作用;ILTV强毒株WG攻毒后,三个重组病毒免疫组在发病率、死亡率以及排毒率方面与对照组均没有明显的差异。重组病毒rLa-gBN,r La-gBC不能提供保护效果,推测可能是由于外源蛋白表达太少且外源蛋白没有组装进病毒粒子等原因引起,具体的机制有待进一步研究。


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