收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

脑心肌炎病毒HB10株感染性cDNA克隆的构建及其应用

于会彬  
【摘要】:猪脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)宿主范围广,可以感染啮齿类动物、猪、大象和非灵长类动物等。有报道称人也可以被感染。EMCV是一个无囊膜的单股正链RNA病毒,属于小RNA病毒科,心病毒属。EMCV基因组全长约7.8 kb,含一个开放阅读框(open reading fragment,ORF),ORF的两边为5'和3'UTR(非翻译区)。5'UTR含有一个介导病毒多聚蛋白起始合成的内部核糖体介入位点(internal ribosome entry site,IRES)和一个poly(C)结构;3'UTR末端含有一个poly(A)尾巴。病毒的基因组编码一个多聚蛋白前体,在3C蛋白酶的参与下裂解为P1,P2,和P3,但是首次裂解发生在蛋白的复制的延伸过程,早于3C蛋白酶的形成,裂解点位于2A和2B蛋白之间,由NPG(P)基序介导。本研究旨在利用反向遗传操作技术建立EMCV-HB10株的c DNA感染性克隆。采用RT-PCR方法,一次性扩增出EMCV-HB10株全长基因组(包括5'和3'UTR)序列,并直接克隆到低拷贝载体p OK12中,构建含有全长EMCV HB10基因组的重组质粒(p EMCV-C9)。该重组质粒经酶切线性化,体外转录为RNA。将转录产物转染BHK-21细胞中进行拯救病毒。转染细胞36 h后,出现典型的细胞病变(cell pathogenic effect,CPE)。拯救病命名为r EMCV-C9并经RT-PCR扩增并全基因组测序鉴定。5'UTR序列比对显示,拯救病毒含有9 bp的poly(C),而亲本病毒的poly(C)结构为C7TCTC3TC10,长度为24 bp。该差别可以作为区别亲本病毒EMCV-HB10和拯救病毒r EMCV-C9的一个基因标志。除poly(C)的长度外其余序列均与亲本病毒一致。间接免疫荧光(Indirect immunofluorescence assay,IFA)和生长曲线试验结果显示,poly(C)长度减少不影响病毒的拯救,拯救病毒与亲本病毒具有相似的生长特性。动物感染试验结果显示,r EMCV-C9的LD50是2×104 TCID50,为亲本病毒EMCV-HB10的213倍,以上结果证明poly(C)的长度对病毒在BHK-21细胞上的生物学特性没有显著影响,但是缩短poly(C)降低了病毒对小鼠的致病力。重组拯救病毒r EMCV-C9得到了部分致弱。已有的研究表明,致弱的门戈病毒(Mengo virus)可以作为潜在的活病毒载体表达异源抗原。缩短poly(C)的EMCV感染性克隆平台的建立为研究新型基因工程疫苗提供了有力的工具。EMCV-HB10在BHK-21细胞上连续190次传代和蚀斑克隆(plaque clone assay),我们成功获得了一株克隆毒株,命名为EMCV-P190-C25。全病毒基因组测序表明,相对于亲本病毒EMCV-HB10,EMCV-P190-C25的2A蛋白缺失了127个氨基酸,还有一些氨基酸发生突变。随后我们将该病毒的部分基因克隆到p EMCV-C9骨架中,构建了一个重组病毒载体,命名为p C9-P190-?2A。在VP1和Δ2A的序列之间依次插入了一个起始裂解点,一个Flag标签和一个多克隆位点,并命名为p C9-P190-Flag-MCS-?2A。该重组质粒经Bam H I线性化后,体外转录的RNA对BHK-21具有感染性,获得的病毒命名为r C9-P190-Flag-MCS-?2A。动物试验结果表明,r C9-P190-Flag-MCS-?2A不引起小鼠死亡且无任何临床症状。为检测该病毒表达外源蛋白的能力,我们在p C9-P190-Flag-MCS-?2A的多克隆位点插入720 bp的e GFP基因并成功拯救出重组病毒,命名为r C9-P190-Flag-e GFP-?2A,该病毒在BHK-21细胞上连续传代,5代内仍然可以稳定表达e GFP外源蛋白,western blot检测表明,e GFP存在两种表达形式,一种为GFP单独表达,一种为e GFP-VP1融合表达。总结以上试验结果,我们成功构建了EMCV-HB10的全长感染性克隆平台,利用蚀斑克隆方法分离了一个2A蛋白缺失毒株,并在此基础上构建了一个无毒力的病毒载体,可以用于外源蛋白的表达和病毒感染的示踪。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 白娟;蒋康富;王先炜;李玉峰;姜平;;一株猪源脑心肌炎病毒的分离与鉴定[J];中国兽医科学;2010年12期
2 凡静静;冯若飞;马忠仁;;脑心肌炎病毒及其蛋白结构和功能研究进展[J];动物医学进展;2012年02期
3 张海霞;冯若飞;王丹;凡静静;李向茸;杨妍梅;马忠仁;冯玉萍;;脑心肌炎病毒的体外细胞增殖培养及其冻干保存试验[J];中国兽医科学;2012年11期
4 王丹;冯若飞;张海霞;凡静静;谢晶莹;马忠仁;冯玉萍;;脑心肌炎病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立及初步应用[J];中国兽医科学;2013年10期
5 Thomas G.Murname;贾伟;;脑心肌炎病毒[J];实验动物科学;1986年02期
6 黄绍棠;对脑心肌炎病毒的最新认识[J];中国动物检疫;1994年03期
7 盖新娜;杨汉春;郭鑫;吕艳丽;王芳;陈艳红;查振林;;猪脑心肌炎病毒的分离与鉴定[J];畜牧兽医学报;2007年01期
8 刘洋;马国文;;猪病毒性脑心肌炎的诊断与防制[J];内蒙古民族大学学报(自然科学版);2013年06期
9 赵婷;张家龙;盖新娜;郭鑫;周磊;陈艳红;查振林;杨汉春;;猪源和鼠源脑心肌炎病毒分离株基因组的比较分析[J];畜牧兽医学报;2009年06期
10 常洪涛;刘慧敏;陈陆;杨霞;赵军;王新卫;姚惠霞;王川庆;;不同动物源脑心肌炎病毒的分离、鉴定和全基因组序列分析[J];中国兽医学报;2014年09期
11 董昕欣;郭鑫;杨汉春;盖新娜;陈艳红;查振林;;猪脑心肌炎病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定[J];中国兽医科学;2007年01期
12 魏莹;盖新娜;贾红;郭鑫;杨汉春;;猪脑心肌炎病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及其识别表位分析[J];中国动物传染病学报;2009年01期
13 凡静静;冯若飞;杨妍梅;张海霞;李向茸;王丹;谢晶莹;马忠仁;;脑心肌炎病毒VP1基因真核表达载体的构建及表达[J];中国兽医科学;2013年03期
14 陈进喜;施开创;黄胜斌;陆文俊;屈素洁;郑敏;李军;;猪脑心肌炎病毒GXLC株的分离及其3D基因分子特征的分析[J];中国畜牧兽医;2011年01期
15 王岩;黄丽;崔尚金;李江南;杨春梅;于会彬;郭东伟;张元峰;夏雪山;翁长江;;猪脑心肌炎病毒2B蛋白与RACK1蛋白相互作用的鉴定[J];中国预防兽医学报;2014年05期
16 闭璟珊;杜以军;白娟;姜平;;脑心肌炎病毒3C蛋白抑制IFN-β信号通路的研究[J];南京农业大学学报;2014年03期
17 韩研妍;姜平;顾小雪;李玉峰;;人工合成的脑心肌炎病毒VP1表位基因在大肠杆菌中的表达与抗原性测定[J];南京农业大学学报;2005年04期
18 白娟;蒋康富;李玉峰;王先炜;姜平;;猪脑心肌炎病毒NJ08株基因组序列测定与分析[J];中国预防兽医学报;2011年05期
19 常洪涛;刘慧敏;陈陆;杨霞;赵军;王新卫;姚惠霞;王川庆;;不同猪源脑心肌炎病毒的分离、鉴定和全基因组序列分析[J];畜牧兽医学报;2014年06期
20 李向茸;冯若飞;凡静静;张海霞;韦鹏建;樊得英;马忠仁;;脑心肌炎病毒VP1结构蛋白的可溶性表达及鉴定[J];中国兽医科学;2011年06期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 张岭岭;王金凤;王娇;赵泽坤;孙继国;袁万哲;;猪脑心肌炎病毒的分离与鉴定[A];中国畜牧兽医学会食品卫生学分会第十一次学术研讨会论文集[C];2010年
2 张永宁;盖新娜;郭鑫;杨汉春;;自噬促进脑心肌炎病毒在宿主细胞中的复制[A];中国畜牧兽医学会生物制品学分会中国微生物学会兽医微生物学专业委员会2010年学术年会(第三届中国兽药大会学术论坛)论文集[C];2010年
3 盖新娜;杨汉春;郭鑫;吕艳丽;王芳;陈艳红;查振林;;猪脑心肌炎病毒的分离与鉴定[A];第四届中国畜牧科技论坛论文集[C];2009年
4 贺东生;李康宁;;猪脑心肌炎病毒分子生物学和诊断方法的研究进展[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会论文集(上册)[C];2009年
5 施开创;陈进喜;屈素洁;许瑞胜;熊毅;刘棋;陈汉忠;李刚;;猪脑心肌炎病毒SYBR Green Ⅰ real-time PCR检测方法的建立[A];第四届中国畜牧科技论坛论文集[C];2009年
6 魏莹;盖新娜;贾红;郭鑫;杨汉春;;猪脑心肌炎病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及其识别表位分析[A];微生物与人类健康科技论坛论文汇编[C];2009年
7 陈兴慧;何庆东;白娟;王先炜;姜平;;脑心肌炎病毒VP1蛋白B细胞表位解析与阻断ELISA抗体检测方法的建立[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会论文集[C];2013年
8 张国庆;郭鑫;盖新娜;杨汉春;;猪脑心肌炎病毒BJC3分离株全基因组序列测定与分析[A];中国畜牧兽医学会2006学术年会论文集(下册)[C];2006年
9 贾红;盖新娜;陈振海;郭鑫;杨汉春;;siRNA特异性抑制猪脑心肌炎病毒在BHK-21细胞中的复制[A];微生物与人类健康科技论坛论文汇编[C];2009年
10 盖新娜;杨汉春;郭鑫;陈艳红;查振林;;猪脑心肌炎病毒分离毒株VP1和3D基因的序列分析[A];第一届中国养猪生产和疾病控制技术大会——2005中国畜牧兽医学会学术年会论文集[C];2005年
中国博士学位论文全文数据库 前3条
1 冯若飞;脑心肌炎病毒双抗原夹心ELISA建立、血清学调查、毒株分离及RNA干扰研究[D];中国农业科学院;2014年
2 侯磊;脑心肌炎病毒非结构蛋白参与病毒诱导细胞自噬和凋亡的分子机制[D];中国农业大学;2014年
3 盖新娜;猪脑心肌炎病毒VP1基因的原核表达、血清学调查及分离毒株的鉴定[D];中国农业大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 张岭岭;猪脑心肌炎病毒的分离鉴定及RT-LAMP快速检测方法的建立[D];河北农业大学;2011年
2 韦鹏建;脑心肌炎病毒VP1片段基因稳定性、原核表达及应用研究[D];西北民族大学;2011年
3 张国龙;猪脑心肌炎病毒VP1蛋白的表达与单克隆抗体的研制[D];南京农业大学;2010年
4 张海霞;脑心肌炎病毒LAMP及Real-time PCR检测方法的建立及初步应用[D];西北民族大学;2013年
5 陈宏备;猪源脑心肌炎病毒GXLC株致病性研究[D];广西大学;2011年
6 杨妍梅;脑心肌炎病毒细胞受体筛选及初步鉴定[D];西北民族大学;2014年
7 陈兴慧;猪脑心肌炎病毒VP1蛋白B细胞表位解析及其阻断ELISA抗体检测方法的建立[D];南京农业大学;2013年
8 凡静静;脑心肌炎病毒VP1基因重组腺病毒的构建及对小鼠免疫效果研究[D];西北民族大学;2013年
9 王丹;人脑心肌炎病毒IgM捕获ELISA方法的建立及初步应用[D];西北民族大学;2014年
10 刘兰亚;猪脑心肌炎病毒非结构蛋白2C的原核表达与间接ELISA方法的建立[D];河北农业大学;2009年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978