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胶质类芽孢杆菌胞外多糖调节及相关基因的转录分析

王庆峰  
【摘要】:胶质类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)因其具有多功能、强抗逆等特点而成为微生物肥料的首选菌种。但该菌在生长过程中产生肥厚的胞外多糖,消耗大量营养,并形成菌胶团,限制了菌体繁殖空间,降低了发酵密度,制约其生产应用。本研究在前期研究的基础上,以实验室筛选获得的优良菌株P.mucilaginous 3016为研究对象,进行产生胞外多糖影响因素研究,确定多糖形成的主控因子,借助响应面分析法(RSM)优化初级种子培养基,延缓该菌胞外多糖产生时间,减少胞外多糖产生量,提高其菌体密度与后续发酵效率;进一步在设置产多糖量显著差异的2种典型诱导条件下,利用RNA-Seq技术进行该菌株的转录表达谱分析。研究结果对揭示胶质类芽孢杆菌生成多糖的机制和调控途径、提高菌含量和发酵效率具有一定理论价值和现实意义。本研究取得了如下3方面的结果:1.优化了胶质类芽孢杆菌初级种子培养基,减少了胞外多糖的产生,提高了菌生长密度。通过单因子试验确定了适合菌体生长的碳源和氮源分别为麦芽糖和胰蛋白胨;利用PB(Plackett--Burman)设计评价了9个试验因素对胶质类芽孢杆菌3016产胞外多糖影响的显著性,确定麦芽糖和MgSO4·7H2O对胶质类芽孢杆菌的影响达到显著水平;利用响应面分析法确定降低胞外多糖产生量、增加菌体发酵密度的最优培养条件,即:麦芽糖2.5g/L,胰蛋白胨1.0g/L,MgSO4·7H2O 0.73g/L,K2HPO4·3H2O 0.4g/L,NaCl 0.06 g/L,FeCl3 0.6mg/L,水杨酸10mg/L,CaCO3 1.0g/L。使用该优化培养基,可将菌体多糖含量降低至0.0302 mg/mL,初级种子液有效菌含量达到4.12×108 cfu/ml,较优化前提高了近10倍。2.分析了P.mucilaginous 3016在多糖产生差异显著的培养条件下的转录表达差异。在多糖产生差异显著的2个培养条件下,利用RNA-Seq技术进行的菌株3016转录组测序结果表明,无氮优化培养基(9hN-)诱导条件下测得的高质量序列为13,632,780条,高质量的碱基达1,213,558,873 bp;优化培养基(9hN+)诱导条件下测得的高质量序列为10,007,128条,高质量的碱基达90,4993,481 bp;基因显著性表达差异(9hN-vs 9hN+)分析表明,共有1580个基因的差异表达水平达到显著,其中上调表达的基因有1084条,下调表达的基因共有496条;上述差异基因主要参与GO功能分类中的生物过程(包括生物调节、细胞过程、细胞定位、代谢过程、生物过程调节等)、细胞组分(细胞、细胞膜以及大分子复合物)、分子功能(结合蛋白和催化活性)等生命过程。3.进行了P.mucilaginous 3016胞外多糖形成相关基因的转录分析。在9hN-诱导条件下,糖酵解途径中的前两个关键酶都上调表达,而丙酮酸激酶下调表达,而在糖异生途径中第一个酶和第二个酶都上调表达,其他两个酶表达差异不显著,暗示在糖异生和糖酵解途径中很可能生成共同的中间产物——磷酸果糖,它是合成核苷酸糖的主要底物。在氨基糖和核苷酸糖途径中发现了显著上调的基因pgm和glgC,证明在胞外多糖形成时需要活化核苷酸糖;糖基转移酶基因显著上调,表明该酶在细菌胞外多糖的合成过程中极其重要;具有转运和调节胞外多糖形成的基因lip、galE和其他胞外多糖形成相关的基因cps也上调表达;与氮代谢相关的glnA编码谷氨酰胺合成酶基因在2种典型培养条件下表达差异显著,说明这些基因与胞外多糖形成相关。


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