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利用AhCMO、AhBADH和AtNEK6基因提高植物耐旱、耐盐性的研究

翟红红  
【摘要】:我国是一个农业大国,作物增产、农民增收和粮食安全是保障我国经济和社会发展的重要基础。但是,由于人口不断增加和农业用地面积逐年减少等原因,导致我国人口与土地资源的矛盾日益突出,这一矛盾为棉花育种、栽培和增产提供了新的挑战和机遇。目前,我国有大量的盐碱和干旱土地待开发和利用,因此利用现代作物分子设计育种技术,培育转基因耐旱耐盐碱棉花新品种,对充分利用干旱和盐碱地,促进棉花产业的发展及保障我国经济和社会发展具有重要意义。作物在干旱和盐碱等非生物逆境胁迫条件下,通常表现为生长减慢、早衰和减产等现象。通过对在干旱和盐碱土壤中生长的植物的研究发现,植物能通过多条途径应对非生物逆境胁迫,例如增加渗透调节物质、调控细胞周期加速细胞分裂与生长等。研究发现,甜菜碱是一种比较理想的非毒性渗透调节物质,具有调节细胞渗透压,稳定细胞生物大分子的结构等功能,而CMO和BADH是植物中甜菜碱合成途径相关的两个关键基因;NEK6基因编码一种丝/苏氨酸蛋白激酶,具有调控植物细胞周期蛋白基因表达和乙烯信号转导的功能,与植物抵抗逆境胁迫相关。本文通过提高植物体内甜菜碱的累积以及At NEK6基因的表达两条途径,来提高烟草和棉花的耐旱耐盐碱能力,为培育转基因耐旱耐盐碱新材料提供依据。本研究取得的进展如下:1、分别将Ah CMO-Ah BADH双基因和Ah CMO和Ah BADH单基因克隆到p BI121载体,构建转基因表达载体,转化烟草并获得T2代转基因后代。通过q RT-PCR分析,转基因烟草中基因均表达。甜菜碱检测结果表明,转基因植株的甜菜碱含量相对于对照都有所提高,其中转双基因株系的甜菜碱含量是转单基因株系的2.1倍,是野生型的10.9倍。在1/2MS培养基中添加200 m M的甘露醇和150m M的Na Cl进行干旱和盐胁迫处理烟草,结果表明转基因植株的根长和侧根数都比对照表现好,而且转双基因株系的根长较单基因株系分别提高了24.2%和26.5%,侧根数分别提高了47.2%和58.5%。在盆栽试验中,转基因植株长势好于对照,转双基因植株的鲜重较单基因植株分别提高33.8%和34.7%。同时,对甘露醇和Na Cl处理的转基因植株分别测定了细胞渗透压、叶绿素荧光参数、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性及丙二醇和脯氨酸的含量。渗透压分析结果表明,甘露醇和Na Cl处理可以显著提高植株细胞的渗透压,转基因植株渗透压高于对照植株,其中双基因植株的渗透压较单基因植株分别提高了56.3%和51.3%;叶绿素荧光参数实验结果显示,转基因植株的光合生理状况优于对照,转双基因植株优于转单基因植株;超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性分析表明,转基因植株在胁迫环境中分解过氧化氢和超氧化物等有害物质的能力强于对照,转双基因植株又强于单基因植物;丙二醛测定结果表明,转双基因植株含量最低,说明植株的膜脂过氧化程度最低,单价植株次之,对照最高。同时,通过转双基因还有效提高了逆境下细胞脯氨酸浓度。所以,双基因共同作用使植物在逆境中遭受的损害最小。通过对转基因烟草的耐旱耐盐性的系统研究,证明了将Ah CMO和Ah BADH基因同时导入烟草中表达,能够显著提高转基因烟草的耐旱耐盐性。在此基础上,本研究将两个基因同时导入棉花,培育耐旱耐盐碱转基因棉花,目前已经获得20株转基因棉花植株。2、将At NEK6基因导入烟草,获得T2代转基因株系。q RT-PCR分析结果表明,基因在烟草中表达,在非胁迫处理下,转基因材料的根长、侧根数及鲜物质较野生型分别提高6.1%、6.3%和5.9%。在胁迫处理下,转基因材料的长势要好于野生型,甘露醇处理后其根长、侧根数以及鲜物质重分别是野生型的2.0倍、1.7倍和2.3倍;Na Cl处理后分别是野生型的2.1、2.0和2.3倍。叶绿素荧光参数实验结果显示,胁迫下转基因植株的光合生理状况同样优于野生型。SOD,CAT的酶活测定结果表明,转基因材料清除过氧化氢和超氧化物等有害物质的能力高于野生型;MDA的检测结果表明,转基因材料的膜脂受损程度要低于野生型;同时转基因材料的脯氨酸的含量均高于野生型。At NEK6转基因烟草的耐旱耐盐性研究结果表明,过表达At NEK6基因不仅可以提高转基因烟草在正常条件下的生物量,同时也可提高其在逆境下的耐盐耐旱性。因此,在此基础上,本研究将At NEK6基因导入棉花,目前已获得了转基因胚性愈伤组织。总之,本研究利用烟草对植物两种抵非生物抗逆境胁迫机制的相关基因进行了系统的研究,证实了Ah CMO和Ah BADH以及At NEK6基因显著提高烟草对干旱和盐碱的抵抗能力,并分别将这些基因导入了棉花,为培育耐旱耐盐转基因棉花品种提供了理论基础,为同时利用不同抵抗非生物逆境途径的相关基因进一步增强转基因棉花耐旱耐盐碱性提供了实验依据。


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