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五指山近交系小型猪骨髓和脐带间充质干细胞的全基因组甲基化和转录组联合分析

吴添文  
【摘要】:不同组织来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)由于其所处的微环境不同,它们的生物学功能也存在着一定的差异。由于人类的MSCs来源有限,因此动物来源的MSCs在细胞治疗中的潜在价值受到了科研人员的重视。而猪MSCs来源丰富,并与人的MSCs相似,使得MSCs在应用于人类治疗之前,可以先用猪源的MSCs作为模型进行临床之前的初步研究。近交系小型猪个体相似性高,其MSCs体系更稳定,有利于建立可靠的、标准的体外评价体系。本研究利用组织贴壁法分离培养了五指山近交系小型猪(Wuzhishan pig, WZSP)的骨髓MSCs (bone marrow MSCs, BMMSCs);和脐带MSCs (umbilical cord MSCs, UCMSCs),并通过细胞表面抗原测定及成骨、成脂分化诱导等方法对所获得的细胞进行鉴定;通过免疫富集DNA甲基化测序(Methylated DNA Immunoprecipitation Sequencing, MeDIP-Seq)和转录组测序(RNA-seq),构建了其全基因组甲基化和转录组图谱并分析两者的关系,分析不同组织来源MSCs的生物学功能的差异性,结果如下: 1、分离的细胞可以贴壁生长,呈长梭形外观,细胞汇合度高时,呈现漩涡样生长;BMMSCs中,造血干细胞标志性抗原CD34和白细胞标志性抗原CD45为阴性,CD9、CD29及CD44为阳性,UCMSCs中内皮细胞标记CD31、造血干细胞标志性抗原CD34和白细胞标志性抗原CD45和为阴性,CD90为阳性;BMMSCs和UCMSCs均具有成骨、成脂分化潜能,且BMMSCs成骨、成脂分化的能力较UCMSCs强;证实我们所分离的细胞为MSCs。 2、通过MeDIP-seq,样品BMMSCs和UCMSCs分别得到约147M原始reads(数据量约7.2G),其中分别约75.52%和76.42%比对上参考基因组;分别约58.98%和60.89%唯一比对到参考基因组。通过RNA-seq,样品BMMSCs和UCMSCs分别得到53M原始reads(数据量约4.8G),其中分别约59.90%和59.83%比对上参考基因组,分别约53.87%和53.84%唯一比对到参考基因组上。MeDIP-seq测序结果表明,两种细胞的亚端粒区都表现出高甲基化状态,且BMMSCs亚端粒区的甲基化程度高于UCMSCs,可能BMMSCs的染色体结构较UCMSCs稳定;BMMSCs和UCMSCs中,promoter区和基因body区的甲基化都会影响基因的表达量,且promoter区甲基化对基因表达量影响更大。本研究筛选出587个启动子区域DNA甲基化差异基因,1979个差异表达基因,这些基因参与着众多的生物学过程,说明不同组织来源的MSCs由于所处的微环境不同,其生物学功能也具有一定的差异。进一步分析发现,102个同时存在启动子区域DNA甲基化差异和表达差异的基因,这些基因参与调控成骨、成脂、成心肌分化,细胞迁移,免疫活性等,说明这些差异基因可能是通过甲基化的调控,影响着不同组织来源MSCs组织修复能力。 总之,本研究首次构建了猪不同组织来源MSCs全基因组甲基化和转录组联合图谱,说明不同组织来源MSCs可能具有不同的临床应用范围。本研究将为人类MSCs的临床应用提供了分子理论基础。


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