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肉食动物细小病毒流行株分子特征与致病性分析

王建科  
【摘要】:肉食动物细小病毒属于细小病毒科、原细小病毒属成员,包括犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV),猫细小病毒(Feline parvovirus,FPV)和水貂肠炎病毒(Mink enteritis virus,MEV)等。该病毒能感染猫科、犬科、鼬科、浣熊科及灵猫科等家养及野生多种动物发病,肉食动物细小病毒引起的疾病存在于世界各地,是危害上述肉食目动物的主要传染病之一,每年都造成巨大的经济损失。CPV、FPV和MEV等肉食动物细小病毒关系密切,本文从分子诊断学、流行病学、免疫原性及遗传进化、转录组学等方面对我国肉食动物细小病毒进行了研究和探讨。首先建立了肉食动物细小病毒通用的纳米PCR检测方法,为我国肉食动物细小病毒流行病学调查提供了有效的手段。该方法敏感性可以检测到8.75×101个拷贝的重组质粒,是传统PCR的100倍;特异性试验表明本方法适合于CPV、FPV和MEV等肉食动物细小病毒的检测,而与其他相关病毒均无交叉反应性;临床样本检测表明本方法适用性良好,对于肉食动物细小病毒感染动物检出率较高。采用分子生物学方法对我国北方主要省市的CPV分子流行病学进行调查,对收集于2013~2016年间的221份CPV病料进行纳米PCR初筛,克隆测序病毒的VP2基因和NS1基因,分析氨基酸位点突变情况,进行同源性比对及系统发育树构建。结果表明我国CPV-2型、2a型、2b型和2c型共同流行,主要流行CPV-2a型,2014年以后北京和河北等地区开始出现CPV-2c型;首次发现VP2上Ala5Gly新的突变,NS1上Val160Gly,Ala586Thr,Ala587Thr和Leu600Arg4个位点发生新的突变;完成了114株病毒VP2基因和49株病毒NS1基因序列测定。进一步对我国流行的不同亚型的CPV进行分离鉴定,对CPV-2c型代表毒株进行免疫原性研究。结果表明,分别分离得到CPV-2型、2a型、2b型及2c型病毒2株、4株、5株和9株,鉴定表明分离毒株具有CPV典型特征,动物回归试验表明试验组比格犬呈现出细小病毒感染的典型症状,免疫原性试验表明分离得到的CPV-2c型毒株能够诱导比格犬产生中和抗体。序列分析表明分离的CPV-2a和CPV-2b型毒株都是Ser297Ala突变的新2a/2b型毒株,CPV-2c具有Ala5Gly突变的变异毒株,国内首次分离鉴定2c型CPV。为研制不同亚型源CPV疫苗提供了基础。为了更好的了解我国MEV的流行情况,采用F81细胞从疑似患有肠炎的水貂粪便样品中分离出2株病毒,经形态学、血清学、动物回归试验和分子生物学鉴定,分离的病毒为MEV,分别命名为MEV/LN-10和SD12/01。对分离毒株VP2基因及其全基因组进行遗传进化和基因重组分析表明,MEV/LN-10株病毒发生了自然重组,其主要与次要亲本病毒分别是MEV-SDNH株和cpv/nj01/06株,首次发现CPV和MEV的自然重组现象,并且分离到重组毒株。选取遗传背景明确的MEVB株做为肉食动物细小病毒代表,利用RNA-Seq技术分析F81细胞感染MEV前后宿主基因转录组的变化,共设感染0 h、3 h、6 h、12 h和24 h五组。结果表明在感染前后共筛选出614个差异基因,其中上调基因123个,下调基因491个;选取了14个差异基因进行了qRT-PCR验证,结果表明测序差异显著的组别与qRT-PCR验证结果一致。功能分析表明这些差异基因与细胞增值和细胞周期、免疫反应、肿瘤发生或抑制、细胞凋亡、信号通路、受体活性、分子传感器活性等相关。本研究构建了F81细胞感染MEV前后的mRNA数据库。


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