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芽孢杆菌遗传操作体系初建及工程菌株分子改良

王慧  
【摘要】:芽孢杆菌(Bacillus)是革兰氏阳性菌,不含内毒素,能够将蛋白质分泌到胞外,是多种重要工业酶的生产菌株。随着分子生物学和基因工程的迅速发展,芽孢杆菌作为基因表达系统得以不断完善,并展现出良好的应用前景。本研究旨在建立和优化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)表达系统,对工业用野生型芽孢杆菌的遗传操作系统进行改良,以进一步提高工程菌株的表达量,并建立具有应用潜力的芽孢杆菌高效表达体系。本文首先对枯草芽孢杆菌表达系统载体进行建立及优化,其中包括含有不同启动子的表达载体(如:组成型启动子P43、乳糖诱导型启动子Pgrac、木糖诱导型启动子Pxyl、淀粉酶启动子PamyQ)、含有不同筛选标记的克隆载体(如:卡那霉素Kan、红霉素Em、氯霉素Cm、四环素Tet)、以及含不同整合位点的整合载体的构建;其次对枯草芽孢杆菌转化方法进行优化,有效的提高了遗传转化效率,从而建立了一套完善的枯草芽孢杆菌表达技术,为外源基因的高效分泌和表达提供平台。利用该表达体系,实现了氨肽酶基因lapB在枯草芽孢杆菌中的高效表达,其摇瓶水平上的酶活达到了58.8 U/mL。通过菌种改良获得了能够进行内源性BamHI甲基化修饰的枯草芽孢杆菌菌株,通过对转化质粒的甲基化修饰,以及感受态制备条件的摸索,建立了中温α-淀粉酶工业生产菌株解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens BF.7658的遗传转化方法。以该高效分泌淀粉酶的菌株为宿主菌,实现了碱性蛋白酶基因的高效异源分泌表达,重组解淀粉芽孢杆菌工程菌株AprEA在摇瓶培养72小时的分泌表达水平可达7800 U/mL,具有较好的应用潜力。解淀粉芽孢杆菌K11是本研究室保存的一株能高效分泌中性蛋白酶的野生型菌株,在摇瓶水平上其中性蛋白酶分泌水平可达到2700 U/mL。为进一步提高其中性蛋白酶的表达水平,本研究克隆了解淀粉芽孢杆菌K11的中性蛋白酶基因K11npr,并构建了游离型表达载体pKan300-K11npr和pUB110-K11npr。将多拷贝的游离型重组质粒转化K11菌株后获得解淀粉芽孢杆菌重组菌F20和110N-6。重组菌F20和110N-6在牛奶初筛平板上的蛋白酶活性明显要高于野生型菌株K11。通过发酵条件优化,重组菌110N-6在摇瓶水平上的酶活力可达到8995 U/mL,比野生型菌株提高了2倍多,在15升发酵罐的酶活力可达到24,000-28,000 U/mL,是目前已报道表达水平最高的中性蛋白酶。重组表达质粒的不稳定性很大程度上限制了含高拷贝游离质粒的重组芽孢杆菌的广泛应用。本研究所构建的两个游离型表达载体pKan300-K11npr和pUB110-K11npr,其最大的差异是前者含有能在大肠杆菌中复制的pBR322-ori复制元件,而后者中只含有芽孢杆菌复制元件。对重组菌的遗传稳定性分析结果表明:重组菌F20的遗传稳定性远远不如重组菌110N-6,在无选择压力的培养基上连续传代,重组菌F20传至第八代后质粒即全部丢失,而重组菌110N-6传至一百代,质粒稳定性仍保持在90%以上。推测表达载体中同时含有两种不同的复制元件可能是质粒在芽孢杆菌中不稳定的重要原因之一。本研究所构建的重组质粒pUB110-K11npr在菌株110N-6中非常稳定,可以满足工业化大生产要求。枯草芽孢菌株AS.1398是经过长期诱变获得的表达中性蛋白酶的商业菌株。通过研究不同浓度的氨苄青霉素对菌株细胞壁合成的抑制作用,建立了AS.1398菌株的遗传转化方法。将重组表达载体pUB110-K11npr导入AS.1398菌株中获得的解淀粉芽孢杆菌重组菌,其中性蛋白酶的分泌能力比AS.1398菌株的酶活力提高一倍,在摇瓶水平上其酶活力可达到9295 U/mL。本研究从多个方面对枯草芽孢杆菌表达系统进行了优化,并尝试了多种野生型芽孢杆菌的转化条件,成功建立了针对野生型芽孢杆菌的遗传转化体系,同时解决了芽孢杆菌中重组质粒不稳定的难题,为工业菌株发展成为新的基因工程表达体系提供新的思路。


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