营养胁迫下耐辐射异常球菌全局调控蛋白CarD的负调节机制

【摘要】：营养胁迫是细菌生理过程中最普遍的环境胁迫因子,细菌通过控制rRNA合成以及信号分子(p)ppGpp介导的严谨反应,快速改变基因的表达,以适应营养环境的变化。已有研究发现一些细菌存在类似于真核HMGA(high-mobility group A)的全局调控蛋白CarD,在细菌参与营养胁迫和非生物胁迫反应调控中发挥着重要作用。耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans)具有对极端恶劣环境极强的适应能力,基因组序列分析显示该菌含有一个CarD蛋白。但是,耐辐射异常球菌CarD是否参与细胞生长和营养胁迫反应的调控,以及如何控制rRNA以及(p)ppGpp合成的作用机制尚不清楚。本研究通过构建耐辐射异常球菌CarD突变株、表型分析、β-半乳糖苷酶活性测定、qRT-PCR、CHIP、蛋白质组学等对CarD在营养等胁迫反应的调控进行了研究,取得如下结果:1.CarD蛋白序列同源比较显示异常球菌属的CarD蛋白具有很高的相似性,在系统进化过程中来源于同一个祖先。耐辐射异常球菌与已报道的其他属细菌CarD相似性最高的是Thermus aquaticus,与粘细菌、分枝杆菌的CarD亲缘关系较远,属于不同的进化分支。粘细菌CarD共316个氨基酸,与CarG蛋白形成全局转录调控复合体,而分枝杆菌和耐辐射异常球菌没有类似CarG的蛋白质,而且CarD长度比较短,分别为162和169个氨基酸。分枝杆菌和耐辐射异常球菌的CarD蛋白相似性也很低(26%)。由此推测耐辐射异常球菌CarD与已报道的粘细菌、分枝杆菌的CarD功能存在差异。2.在营养胁迫条件下,carD基因的表达显著增加(2倍以上),表明carD基因受营养饥饿诱导。为了研究耐辐射异常球菌CarD的功能,我们构建了carD缺失突变株、回补株和过表达菌株,发现在正常条件和营养胁迫下,carD基因缺失均导致16S r RNA基因表达上调2倍以上;而relA基因在营养胁迫条件下表达显著下调(2倍)。利用报告基因lacZ分析16S rRNA和relA基因启动子活性的结果表明CarD抑制16S r RNA合成、激活relA基因表达。CHIP实验结果显示CarD蛋白与16S rRNA和relA基因启动子互作。为进一步研究CarD调控作用,我们构建了过量表达菌株,发现16S rRNA基因的过量表达导致细胞在营养胁迫下生长速率下降,对热胁迫敏感,UV辐射抗性增强,与carD缺失突变株的表型一致。此外,我们构建了(p)ppGpp合成/水解酶缺失突变株,由于耐辐射异常球菌有2个与(p)ppGpp合成/水解酶相关的基因(rel A和relQ),通过对relA和relQ单、双突变株及回补株的细胞生长分析发现relA和relQ缺失突变导致细菌对氨基酸饥饿、H_2O_2和热胁迫敏感,与carD缺失突变株的表型一致。进一步分析发现relA和relQ双突变菌株不能在限制性培养基中生长,而过量表达合成酶基因(relQ)或RelA合成保守结构域片段(编码RelA N’端HDc和RSD结构域的DNA序列)导致细胞生长能力显著下降。已有的研究表明(p)ppGpp作为信号分子通过触发细胞的严谨反应对生长速率进行调节,具有(p)ppGpp合成和水解酶活性双功能的RelA在控制细胞内(p)ppGpp含量发挥关键性作用。因此,在营养胁迫条件下,耐辐射异常球菌CarD通过激活relA基因表达,控制细胞内(p)ppGpp的含量,抑制细胞生长。3.研究结果表明耐辐射异常球菌CarD与至今研究最为深入的分枝杆菌和粘细菌的CarD之间具有类似的功能,同时存在一定差异。酵母双杂实验显示耐辐射异常球菌CarD与RAN聚合酶β’亚基互作,这与分枝杆菌的研究结果相符;粘细菌中CarD受蓝光诱导,参与类胡萝卜素的合成调控,而耐辐射异常球菌CarD受营养、氧化和UV胁迫诱导。并且,CarD除参与营养胁迫反应的调控外,还直接或间接地参与氧化、UV辐射等胁迫反应。CarD作为全局调控蛋白参与多重胁迫反应的作用机制还有待进一步研究。综上所述,耐辐射异常球菌CarD在逆境胁迫尤其是营养胁迫过程中通过负调控16S rRNA基因表达,或激活(p)ppGpp合成/水解酶relA基因的表达,控制细胞内(p)ppGpp的含量,调节细胞生长速率,在营养胁迫反应过程中起负调控作用。