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抗镰刀菌根腐病苜蓿品种的鉴定及蛋白质组学研究

丛丽丽  
【摘要】:紫花苜蓿镰刀菌根腐病是一种慢性的潜在的世界性病害,在大多数产区均有发生。紫花苜蓿感染根腐病初期维管束变成褐色或红褐色,严重时整个主根内部腐烂,分枝减少,侧根大量死亡,固氮能力降低,寿命和利用年限缩短,草产量和品质急剧下降。已报道紫花苜蓿镰刀菌根腐病的病原主要为腐皮镰刀菌(F.Solani)、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)和锐顶镰刀菌(F.acuminatum)等菌种,镰刀菌属的其他致病性菌种报道较少。为查明是否有我国或世界上未发现的可引起紫花苜蓿根腐病的镰刀菌菌种以及探讨紫花苜蓿响应镰刀菌侵染的机制,本研究于2012-2013年对河北廊坊、内蒙古临河和山西阳高县的大面积栽培紫花苜蓿进行田间调查,采集疑似感染镰刀菌根腐病的紫花苜蓿病株,在PSA和MGA等培养基上分离纯化,观察菌落形态、颜色及分生孢子的大小、形态等指标,并克隆其ITS和TEF-1α序列进行分子生物学鉴定。通过在NCBI和Fusarium-ID镰刀菌属数据库进行比对,结合形态学观察确定菌种名称,然后通过回接试验确定其致病性。根据以上试验结果,利用致病性较强的菌株对14个紫花苜蓿品种进行抗病性评价,并通过透射电镜观察接种后紫花苜蓿根部的细胞形态和侵染机制。将抗病性最强和最弱的两个材料用于紫花苜蓿响应镰刀菌侵染的蛋白质组学研究,探讨紫花苜蓿接种镰刀菌后的应答机制。其主要试验结果如下:共分离6个菌株,分别命名为C1、C2、C3、C4、C5和L1。根据形态学和分子生物学鉴定:C1和C2为三线镰刀菌(F.tricinctum);C3、C4和C5为腐皮镰刀菌(F.solani);L1为层出镰刀菌(F.proliferatum)。L1和C4菌株的致病性较强,发病率(DI)均大于80%,病害严重指数(DSI)分别为61.35%和59.26%。C2株系致病性最弱(DI 54.44%,DSI 29.63%)。C1、C3和C5菌株的发病率和致病性均无显著差异,发病率分别为66.66%、62.22%和65.55%;病害严重指数分别为42.59%、40.37%和38.89%。其中三线镰刀菌和层出镰刀菌是首次发现可引起我国紫花苜蓿根腐病的病原菌。通过水培法和土培法接种L1菌株后,14个紫花苜蓿品种均感病,没有免疫品种。水培接种法病情发展较快,接种5-7天感病植株开始表现病害症状。接种14天后调查显示,感病植株根部坏死严重,地上部黄化。病害严重指数为41.5%~63.7%。其中AmeriGraze 401+Z(41.5%)和WL903(43.0%)的抗病性较强,其次是Beaver(44.4%)、中苜2号(47.4%)、Affinity(50.4%)和Alfking(50.4%)。肇东(56.7%)和WL656HQ(63.7%)的抗病性最弱。土培接种前期,根腐病发展较缓慢,接种80天后进行病害调查,感病植株根茎坏死或有病斑。病害严重指数在38.9%~60.0%之间,其中AmeriGraze 401+Z和Affinity的抗病性较强,病害严重指数分别为38.9%和40.4%。其次是WL903(42.8%)、Alfking(43.7%)和Beaver(43.9%)。WL656HQ(60.0%)和肇东(61.8%)抗病性最弱。综合两种接种方法的结果,抗病性最强的是AmeriGraze 401+Z,最易感病的是WL656HQ。以抗病品种(AmeriGraze 401+Z)和感病品种(WL656HQ)为材料,接种镰刀菌后,采用双向电泳技术对根部组织和叶部组织进行蛋白质组学分析,成功鉴定了93个差异蛋白点。其中66个来自根部组织,27个来自叶部组织。这些蛋白包括S-腺苷甲硫氨酸合成酶、谷胱甘肽转移酶和HSP70等。通过GO分析,发现这些蛋白主要参与抗病防卫、能量调控、蛋白合成与转运、类黄酮次生代谢等途径。选择其中的13个蛋白点进行qRT-PCR的鉴定,进一步验证其表达模式。结果显示,这些蛋白的差异表达在紫花苜蓿抵御病原菌侵害的过程中可能起到关键性作用。本研究将为紫花苜蓿及其近缘种根腐病的相关研究提供参考。


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