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甘蓝类蔬菜抗根肿病基因定位、克隆及抗感材料比较转录组分析

张小丽  
【摘要】:十字花科根肿病是由芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae Woron.)侵染引起的一种土传病害,严重威胁着青花菜及其他十字花科蔬菜的生产,培育抗病品种是防治根肿病最有效的方法。本研究针对根肿病抗源筛选、抗病基因定位和克隆及抗病机理研究等方面开展了一系列工作,主要结果如下:1.以根肿菌四号小种为接种物,对176份甘蓝类材料进行了抗病性鉴定,初步获得6份高抗(HR)材料,48份抗病(R)材料,这些材料有待于进行重复鉴定。对以抗根肿病甘蓝先甘336及花椰菜托尼为母本与青花菜及甘蓝杂交获得的F1代进行了抗病性鉴定,大多数F1代的病情指数比父本降低,但也有部分F1抗病性明显增强。2.分别以甘蓝基因组02-12及TO1000DH为参考对甘蓝近缘野生种B2013,青花菜自交系90196进行重测序分析,找出2个亲本之间的多态性SNP及In Del变异,纯合的In Del用于标记开发,共设计了2万多对In Del引物,81.78%可以在双亲间扩增出差异条带。3.抗病亲本B2013和感病亲本90196表型稳定,F1病情指数介于双亲之间且偏向于抗病父本,两个亲本构建的分离群体中所有单株抗病级别的分布呈连续性,说明抗病性状是一个多基因控制的数量性状,且存在显性的主效基因。4.通过QTL-seq结合生物信息学分析发现在甘蓝9号染色体上32.01-40.01Mb之间出现了SNP-index不平衡的现象,同时此区域的?(SNP-index)在99%的置信水平下大于阈值,说明该区域可能是控制甘蓝根肿病抗性的一个QTL位点,记为Bo CR9.1。传统遗传连锁分析方法验证了9号染色体上的这个QTL位点,并将Bo CR9.1缩小至9号染色体上38.79Mb到39.35之间的560Kb内。5.根据甘蓝参考基因组02-12注释信息,在Bo CR9.1的560Kb区间内共有108个基因,结合QTL-seq预测结果,发现基因Bol044005存在非同义SNP位点且与抗病相关,该基因编码TIR-NBS-LRR(TNL)类蛋白,推测为Bo CR9.1的一个候选基因。根据Bol044005的序列信息设计引物,通过分段扩增和克隆测序拼接获得了c DNA的全长序列,发现其编码区在抗感亲本间有26个SNP,造成14个氨基酸突变,这些变异位于Bol044005蛋白TIR与LRR结构域。6.通过显微观察,发现抗感病亲本的根毛侵染期及皮层侵染期均出现在7DAI与14DAI,选取3个时期取样(0DAI、7DAI、14DAI)进行转录组测序。结果显示,寄主对根肿菌的防御反应在早期被诱导且相关途径在T14时期受到抑制,与细胞壁成分、硫甙葡萄糖苷合成及植物信号转导相关的基因均在侵染早期表达。双亲间存在较多DEGs包括NBS-LRR、SA代谢相关、细胞壁重塑、几丁质酶等基因,这些基因的差异表达可能是造成抗感亲本呈现不同抗病性的原因。


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