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三唑磷农药生物条形码免疫分析方法研究

杜鹏飞  
【摘要】:农产品质量安全问题事关人民身体健康和生命安全。农药残留作为危害农产品质量安全的关键危害因子之一,逐渐成为社会关注的热点。为了规范农药的合理使用,越来越多的国家制定了严格的农药残留标准。由于许多农药的含量都比较低,为了达到对痕量农药定性分析和定量检测的目的,目前,很多生物信号增强技术(纳米材料,核酸,酶等)被运用到免疫分析方法中来提高检测的灵敏度。常用到的信号增强技术有:酶催化技术、纳米技术、生物素-亲和素技术、分子生物放大技术。本研究以实验室成功应用于各种免疫分析方法的抗三唑磷农药的单克隆抗体为基础,采用竞争反应模式,建立了四种新型的基于生物条形码DNA的新型放大免疫分析方法,为探索环境、食品和卫生领域小分子物质的检测提供了新的思路与技术平台。本研究的主要内容与创新点如下:主要内容如下:1.本研究采用柠檬酸盐还原法合成了粒径大约为15 nm的纳米金溶液。用三唑磷抗体,巯基修饰DNA捕捉链,互补生物条形码DNA修饰15 nm的纳米金形成纳米金复合探针,用透射电镜和紫外光谱对其进行表征。将三唑磷半抗原(THBu)与卵白蛋白(OVA)偶联修饰磁性颗粒上形成磁性探针。磁性粒子表面包被的半抗原与农药分子竞争结合纳米金复合探针表面的抗体建立竞争型免疫化学反应体系。磁分离免疫结合的抗原抗体复合物,采用热变性技术促使纳米金复合探针释放生物条形码,DNA芯片探针和检测探针与释放的生物条形码杂交结合,利用金标银染法在生物芯片上测定生物条形码含量,实现对农药小分子的定量检测。由于一个纳米金复合探针上带有很多的生物条形码,因此,该免疫反应具有比传统的免疫方法更高的灵敏度。该方法的检测范围为0.05~(-1)0 ng mL~(~(-1)),最低检出限(LOD)为0.04 ng mL~(~(-1))。对水样品和苹果进行三唑磷的添加回收实验,检测回收率在55.36%~(-1)07.8%之间,相对标准偏差(RSD)为12.40%-24.93%,在水样品中该方法和ELISA具有很好的相关性,进一步说明该方法的准确性。2.本研究在前一章的基础上同样设计了针对三唑磷农药的纳米金复合探针和磁性探针,并且进一步对合成的纳米金复合探针的稳定性和特异性进行优化。针对生物条形码DNA的序列,设计了能对其进行扩增的上下游引物。引入荧光定量PCR技术替代生物芯片对释放的生物条形码进行检测。优化了引物浓度和退火温度等条件;在最佳的实验条件下,建立了基于荧光定量PCR的生物条形码竞争免疫分析方法实现了对三唑磷农药的检测。此方法对三唑磷农药的检测范围为0.04~(-1)0 ng mL~(~(-1)),最低检出限(LOD)为0.02 ng mL~(~(-1))。利用该方法对空白苹果、柑橘、卷心菜、大米样品进行了三唑磷农药的添加回收实验,样品的添加回收率为73.1%~(-1)04.5%,相对标准偏差(RSD)为10.8%~(-1)9.1%。同时用GC-MS进行确证实验,证明基于荧光定量PCR的生物条形码免疫分析方法检测样品中三唑磷农药结果可靠,能够应用于实际样品中三唑磷的检测。3.为了进一步简化实验步骤,提高方法的实用性和检测灵敏度。构建了一种利用普通酶标仪在酶标板上检测三唑磷农药的生物条形码竞争免疫分析方法。本章中使用的纳米金复合探针只修饰了抗体和单链巯基生物条形码DNA。利用磁分离系统分离免疫结合的抗原抗体复合物后,采用二硫苏糖醇(DTT)解离释放纳米金复合探针表面的生物条形码DNA。释放的生物条形码分别与互补的检测探针和生物素探针杂交,形成杂交结构,然后借助链霉亲和素的作用将杂交结构固定在酶标板上,然后通过纳米金银染放大技术产生放大信号的灰度,通过酶标仪进行检测。本研究建立的基于微孔板银染的生物条形码免疫分析方法,可以直接应用于实际样品的快速检测,检测范围为0.03-40 ng mL~(~(-1))。该方法的最低检测限(LOD)为0.02 ng mL~(~(-1))。利用该方法对苹果和柑橘样品进行了三唑磷农药的添加回收实验,样品添加回收率为61.1%~(-1)07.6%,相对标准偏差(RSD)为8.51%~(-1)8.7%。同时用GC-MS确证,证明该分析方法对三唑磷农药检测结果可靠,能够应用于实际样品中三唑磷的检测。4.为了进一步简化生物条形码的检测步骤,提高方法的灵敏度,使其更好的应用于农产品质量安全检测。在上一章纳米金复合探针的基础上,利用生物素-链霉亲和素系统将辣根过氧化酶固定在纳米金复合探针表面的条形码DNA上,形成了一种酶标纳米金复合探针,并结合竞争免疫分析用于三唑磷农药的检测,该方法检测浓度范围为15.0 ng L~(~(-1))-40.0μg L~(~(-1)),该方法最低检出限(LOD)为14.5 ng L~(~(-1))。由于一个酶标纳米金复合探针上载带有多个HRP分子,因此,该免疫方法的灵敏度比传统ELISA方法的灵敏度高两个数量级。利用该方法对苹果,柑橘,卷心菜和大米样品进行了三唑磷农药的添加回收实验,样品回收率为78.4%~(-1)05.1%之间,相对标准偏差(RSD)为8.09%~(-1)9.1%。同时用GC-MS确证,证明该分析方法对三唑磷农药检测结果可靠,能够应用于实际样品中三唑磷的检测。


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