甘蓝抗枯萎病基因FOC1的功能分析与抗病材料的快速创制

【摘要】：结球甘蓝(Brassica oleracea var.capitata L.)是世界范围内广泛栽培的一种重要的十字花科蔬菜作物。甘蓝枯萎病是一种典型的土传病害,严重影响着甘蓝的产量和品质,并难以通过药剂等措施来防治,培育抗病品种是应对甘蓝枯萎病最为行之有效的方法。本研究采用农杆菌介导转化的方法将甘蓝抗枯萎病基因FOC1导入高感枯萎病的甘蓝自交系材料,以期转化后的感病材料获得枯萎病抗性,验证FOC1基因的抗病功能;利用亚细胞定位实验明确FOC1编码蛋白的性质,并利用生物信息学软件对目的蛋白的组成、结构及可能的生物学功能和参与的生物学途径进行预测分析,为探明抗病基因的抗病机理提供理论依据;综合运用小孢子培养、全基因组背景选择和抗性特异分子标记辅助选择对骨干亲本01-20进行枯萎病抗性转育,以期快速获得优良抗病育种材料。主要研究结果如下:1、通过对本课题11份高感枯萎病甘蓝自交系材料的筛选,其中由XW自交系获得的外植体材料褐化程度最低,分化出芽率最高,是用于遗传转化的优良受体材料。将抗枯萎病基因FOC1通过农杆菌介导法转入甘蓝自交系材料XW,共获得6株阳性植株,对阳性植株进行PCR检测,有4株扩增出目的片段,经RT-PCR检测,FOC1基因在这4棵阳性植株中均显著高表达;经人工接种鉴定,在接种后第10d,对照组感病甘蓝材料发病明显,转基因阳性植株未见发病症状,初步验证候选基因FOC1的抗病功能。2、经亚细胞定位实验,将FOC1编码蛋白定位于细胞核内,判定为核蛋白。经生物信息学预测分析,目的蛋白是一种亲水性蛋白,不存在跨膜区和信号肽识别位点,蛋白二级结构中包含有较多的无规卷曲结构,是典型的TIR-NBS-LRR类的抗病蛋白,可能参与信号转导途径,并具有调控蛋白结合和ADP结合的功能。3、根据亲本01-20(HS)和96-100(HR)的全基因组重测序信息设计并筛选获得24对背景分析标记,利用枯萎病候选基因FOC1的序列位置信息开发出与其紧密连锁且通用性强的SSR标记Frg13,利用小孢子培养获得的抗病DH系材料D134作为抗性供体亲本,结合前景和背景筛选通过回交的方式将枯萎病抗性成功转育到骨干亲本01-20中,创制了骨干亲本抗病导入系YR01-20,显著提高了育种效率,并为甘蓝抗枯萎病育种工作提供了优良的育种材料。