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芳香族污染物降解菌的分离及降解机理研究

任磊  
【摘要】:含苯环结构的芳香族化合物普遍存在于自然环境中,同时也包含了许多人工合成的化工原料,广泛应用于工、农业生产和日常生活中。芳香族化合物种类繁多且使用量大,部分芳香族化合物在环境中长期残留,对生态环境及人体健康形成了巨大的威胁。微生物降解因其高效、低成本和安全的特点成为污染环境生物修复的主要方式。本研究从长期受芳香族化合物污染化工厂废水处理池的淤泥中分离获得一株对硝基苯酚降解菌YC-RL1,该菌株能在60小时将100 mg/L的对硝基苯的降解96.2%。通过菌落形态与菌体形态观察、BIOLOG分析及16S rDNA序列的系统发育分析,将菌株YC-RL1鉴定为节杆菌(Arthrobacter sp.YC-RL1)。通过单因素分析研究了不同环境条件对菌株降解对硝基苯酚能力的影响,结果表明菌株YC-RL1对培养温度(20~40℃)、初始pH(6~9)及盐离子浓度(70 g/L)都具有较宽的耐受范围,适当添加葡萄糖可显著提高菌株的降解能力(≤7.5 g/L),培养转速及菌株的接种量对降解无显著影响。利用响应面分析方法对显著影响菌株降解能力的因素(培养温度、初始pH及葡萄糖添加)进行了优化,获得了最优降解条件为初始pH 7.5、培养温度30℃并额外添加5.3 g/L葡萄糖。底物谱分析表明,菌株YC-RL1可高效降解对二甲苯、联苯、双酚A、菲和萘。通过高效液相色谱串联质谱分析检测了菌株YC-RL1降解对硝基苯酚过程中产生的代谢中间产物,确定了菌株YC-RL1通过偏苯三酚将对硝基苯酚彻底降解并利用。通过模拟土壤修复及发酵罐模拟废水处理探索了菌株的实际应用潜能,结果表明菌株具有良好的应用潜能。菌体的结构特征表明菌株YC-RL1具有趋化性的结构基础(顶生鞭毛),通过平板趋化性及土壤趋化性实验验证了菌株对对硝基苯酚的趋化性。采用第三代测序技术(PacBio测序平台)对菌株YC-RL1的全基因组序列进行了测定,获得了菌株的全基因组序列(CP013297)。菌株YC-RL1含有一个环状基因组(3.8 Mb,G+C含量64.26%)和两个质粒(plasmid01,112Kb,G+C含量57.81%;plasmid02,59Kb,G+C含量58.96%)。对基因组中编码序列(CDS)进行预测得3,578个CDS,其中3,469个CDS被注释到公共数据库(COG、GO、KEGG等)。通过比较基因组学分析对参与芳香族化合物降解的基因,尤其是苯环双加氧酶基因进行了详细的分析,获得5个编码苯环双加氧酶的基因,涉及儿茶酚、联苯、原儿茶酸和对硝基苯酚的降解过程。通过代谢产物分析获得了联苯降解的完整代谢途径,并获得了参与降解过程的完整降解基因簇,其中含有一个新的联苯降解基因簇。对联苯降解关键基因bphC和bphD进行克隆、表达及功能验证,所获得的水解酶BphD为新的C-C键水解酶,并完成了BphD的酶学特征分析。其中,BphD在较宽范围的温度与pH条件下均能保持较高活性,多种金属离子对酶活性具有抑制作用。同时,对BphD的氨基酸序列进行了初步的生物信息学分析。


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