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奶牛乳房炎主要病原菌多重PCR诊断方法的建立与应用

王丹  
【摘要】:奶牛乳房炎是奶牛的一种普通常见多发病,是奶牛乳房受到物理、化学、微生物等致病因子的刺激所发生的一种炎症反应,该病不仅可导致奶牛产奶量和乳品质量的下降,严重时甚至可使奶牛泌乳机能丧失,最终使患牛淘汰,给奶牛养殖业造成巨大的经济损失。为了查明我国部分奶牛场乳房炎主要病原菌区系分布及血清型,建立主要病原菌多重PCR快速诊断技术。本研究对从江苏和甘肃7个奶牛场采集的213份临床型和144份隐性乳房炎奶样进行了细菌分离鉴定,对分离鉴定出的无乳链球菌和金黄色葡萄球菌进行了血清型研究,建立了快速诊断奶牛乳房炎大肠杆菌、无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、化脓隐秘杆菌和副乳房链球菌的多重PCR诊断技术并初步组装出了诊断试剂盒。1.采用16S rDNA分子鉴定技术对从江苏和甘肃7个奶牛场采集的213份临床型和144份隐性乳房炎奶样进行细菌分离鉴定。结果表明,病原菌区系分布主要为大肠杆菌116株(36.94%)、粪肠球菌66株(21.02%)、无乳链球菌63株(20.06%)、克雷伯氏菌23株(7.32%)、金黄色葡萄球菌15株(4.78%)、屎肠球菌14株(4.46%)、志贺氏菌8株(2.55%)、停乳链球菌3株(0.96%)、肺炎克雷伯氏菌3株(0.96%)、乳房链球菌1株(0.32%)、绿脓杆菌1株(0.32%)和化脓隐秘杆菌1株(0.32%)。采用多重PCR的方法对无乳链球菌和金黄色葡萄球菌进行血清型分型,结果表明,分离出的金黄色葡萄球菌血清型主要为荚膜多糖336型,占66.67%,其次为5型,占33.33%。无乳链球菌血清型主要为Ⅰa型和Ⅱ型,分别为60.32%和39.68%。2.以化脓隐秘杆菌ISR基因、无乳链球菌cfb基因、大肠杆菌phoA基因、副乳房链球菌23S rRNA基因和金黄色葡萄球菌nuc基因为靶基因,通过反应条件及反应体系的优化,建立了一种能同时快速检测五种病原菌的多重PCR方法。对临床送检奶样及人工模拟目标乳样进行了检测,同时与测序结果进行了比较,结果其特异性达97.56%~100%,敏感性达95.65%~100%。对五种病原菌最低检测浓度分别为金黄色葡萄球菌6.25×10~4 cfu/mL,大肠杆菌2.95×10~6 cfu/mL,化脓隐秘杆菌2.95×10~5 cfu/mL,副乳房链球菌4.3×10~5 cfu/mL,无乳链球菌3.15×10~5 cfu/mL。3.对建立的多重PCR检测方法,进行了试剂集中整合,统一定量,初步组装出了诊断试剂盒,并对试剂盒保存方式及保存期限进行了测定和评价。结果表明,该试剂盒4℃可保存2个月,-20℃可保存4个月,-80℃可保存6个月,反复冻融对试剂盒影响较大。本项研究对今后奶牛乳房炎主要病原菌快速检测,制定合理有效治疗方案,提高疗效,具有重要的指导意义。


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