解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens K11高效表达体系的建立及其高效表达元件的优化

【摘要】：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)是多种重要饲用酶制剂的生产菌株,因其具有较强的蛋白分泌能力,其在作为高效表达宿主菌方面具有巨大的发展潜力及应用前景。然而,解淀粉芽孢杆菌中存在的限制修饰系统、质粒稳定性差、表达元件缺乏以及内源蛋白酶活力高等问题严重限制了其在基因工程研究中的广泛应用。本研究的核心材料解淀粉芽孢杆菌K11(B.amyloliquefaciens K11)是一株高产中性蛋白酶和角蛋白酶的菌株。前期通过转化条件的摸索和质粒结构元件的优化,已较好的解决了 K11菌株遗传和质粒稳定性差的难题,为将K11菌株开发成为高效的异源蛋白表达宿主奠定了坚实的基础。本研究以解淀粉芽孢杆菌K1 1为宿主菌、克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因BcaprE作为报告基因,通过高产酶蛋白的工业菌株的强启动子(PamyQ、PaprE、Pnpr)和高效分泌信号肽(SPamyQ、SPaprE、SPnpr)的优化组合,筛选适用于K11菌株高效分泌表达外源蛋白的通用表达元件。摇瓶测试结果显示:在以α-淀粉酶基因启动子PamyQ、碱性蛋白酶基因信号肽SPaprE组成的表达元件调控下,碱性蛋白酶基因BcaprE在解淀粉芽孢杆菌K11中的胞外分泌表达水平为最高,可达13804U/mL。该优化组合元件PamyQ-SPaprE,同样也能够有效的引导生麦芽糖淀粉酶基因Gs-MAase(19.0 U/mL)和中性蛋白酶基因Banpr(17000 U/mL)的高效分泌表达。通过敲除K11菌株的内源蛋白酶基因Banpr,碱性蛋白酶BcaprE和生麦芽糖淀粉酶MAase在蛋白酶缺陷型突变株7-6中的表达水平分别提高了 25.0%和19.4%。在15-L发酵罐水平上,碱性蛋白酶重组菌株QC-E分泌BcaprE的水平进一步提高到了 30200 U/mL。为获得不同强度的解淀粉芽孢杆菌分泌表达盒文库,同时也为了探索高效分泌表达元件所介导的高效分泌机制,对高效分泌表达盒PamyQ-SPaprE进行了随机突变研究。通过易错PCR方法构建分泌表达盒随机突变文库,共获得1352个转化子。对这1352个转化子进行活性平板和摇瓶发酵试验,共筛选到20株表达分泌强度较野生型更佳的突变株。该分泌表达盒文库的构建不仅为解淀粉芽孢杆菌表达系统外源蛋白的表达提供更多的平台,也为解淀粉芽孢杆菌高效分泌表达机制的深入研究奠定了基础。以上试验结果充分证明了以解淀粉芽孢杆菌7-6为宿主菌,不同丰度PamyQ-SPaprE为分泌表达盒所建立的解淀粉芽孢杆菌表达体系不仅能够稳定的生产重组蛋白及进行酶蛋白的高密度发酵,而且该表达体系具有较好的通用性,可为更多酶制剂的高效表达提供新的途径。