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生物酶法制备低聚木糖的研究

张玥琦  
【摘要】:低聚木糖作为新世纪以来备受关注和称赞的超级益生元,具有增强免疫力、降低血压血脂、调节肠道菌群、改善食品风味的优质功能。当前低聚木糖的生产方式主要是利用玉米芯的碱抽提及进一步的酶解,而该种方式会消耗大量的酸碱液,环境负担重,本研究的目标是探索寻求绿色环保的酶法制备低聚木糖。当麦麸作为制备低聚木糖的原料时,由于期望制备过程不涉及碱抽提,则酯键依旧存在于木聚糖侧链上,而乙酰木聚糖酯酶在酶水解中起到良好的辅助作用。本研究先从Talaromyces leycettanus JCM12802中克隆出一个带有CBM1结构域的乙酰木聚糖酯酶AXE+CBM1,为探究CBM1作用,将全长和截短的乙酰木聚糖酯酶分别在毕赤酵母中成功表达。将AXE和AXE+CBM1分别与来源于Neocallimastix patriciarum的木聚糖酶NPXYN11协同降解去淀粉麸皮时,还原糖量比单独NPXYN11作用时提高9%和13%,表明乙酰木聚糖酯酶有利于木聚糖酶降解去淀粉麸皮,而且CBM1的存在使其效果更佳。同样地,我们将CBM1结构域引入至木聚糖酶NPXYN11中并在毕赤酵母中成功表达,酶学性质测定表明,CBM1的存在对其影响不大。在降解去淀粉麸皮实验中,底物浓度越高时,其作用效果越强;乙酰木聚糖酯酶先与木聚糖发生作用,消去乙酰基团,能更好地促进木聚糖酶发挥作用。同时AXE+CBM1、NPXYN11+CBM1的组合作用于去淀粉麸皮比NPXYN11、AXE的组合增加了近35%的还原糖;并且木寡糖各组分的比例保持不变,大部分(86%)为木二糖(49%)和木三糖(37%)。木浆废液是造纸工业的废弃资源,有着丰富的木聚糖,也是制备低聚木糖的良好原材料。相较于目前对环境压力大的酸碱沉淀法,这种通过生物酶的高效降解制备低聚木糖的绿色方式更值得研究和推崇。前期研究表明,高温更有利于产物的转化,基于文献报道,我们选择了一个嗜热GH11家族木聚糖酶EVXYN11,在大肠杆菌、毕赤酵母中进行表达,性质测定发现酵母表达的重组酶在热稳定性方面显著弱于大肠杆菌表达,推测在酵母表达过程中糖基化造成热稳定性下降,进而对潜在的3个N-糖基化位点进行突变研究。结果表明,位于拇指Loop上的N135糖基化位点与热稳定性直接相关,进一步通过饱和突变研究获得了超级耐热突变体N135T;当以榉木木聚糖作为底物时,催化效率提升了1.23倍,同时其酶活性在高温下长时间保持稳定(70、80°C保温8 h剩余酶活100%、84%)。特别地,N135T突变体降解木浆废液产生的还原糖量为野生型的2.7倍和商业酶NPXYN11的3.5倍,产物分析表明,木二糖和木三糖的总量可达85%。本研究通过对乙酰木聚糖酯酶与木聚糖酶的协同降解小麦麸皮和超耐热木聚糖酶降解转化木浆废液进行了系统研究,为绿色生产低聚木糖提供良好的思路。


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