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内质网应激抑制猪细小病毒复制的分子机制及其非结构蛋白1核转运机制的研究

曹丽艳  
【摘要】:内质网(Endoplasmic reticulum,ER)应激和未折叠蛋白反应(Unfolded protein response,UPR)与许多哺乳动物疾病,尤其是病毒性疾病有关。猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)是一个小的、无囊膜单股负链DNA病毒,是引起猪繁殖障碍的主要病原之一。尽管有研究表明PPV感染激活内质网应激,但是内质网应激是如何调控病毒复制的具体分子机制仍不清楚。我们的研究发现,PPV感染猪肾(PK-15)和猪睾丸(PT)细胞均可以激活内质网应激,且PPV感染激活内质网应激是通过蛋白激酶R样内质网应激酶(PERK)途径介导的,而不是肌醇依赖酶1(IRE1)和转录激活因子6(ATF6)途径。当用特异性内质网应激诱导剂毒胡萝卜素和衣霉素处理感染PPV的细胞后,我们发现内质网应激诱导剂抑制了病毒的吸附和释放,说明内质网应激的激活负调控PPV的复制。利用RNA干扰(siRNA)敲低细胞内PERK、真核起始因子2α(eIF2α)和转录激活因子4(ATF4)的表达,发现显著增强了 PPV复制。此外,我们还观察到内质网应激抑制PPV感染与细胞凋亡有关。利用特异性细胞凋亡激动剂(Nutlin-3)加速细胞凋亡显著抑制了 PPV复制。促凋亡因子c/ebp同源蛋白(CHOP)的过表达显著降低PPV感染,而利用shRNA敲低CHOP表达又明显促进PPV感染,说明加速内质网应激介导的凋亡抑制PPV的复制。总之,这些结果表明PPV感染通过PERK信号通路激活内质网应激,然后内质网应激通过促进细胞凋亡抑制PPV的复制。非结构蛋白1(NS1)是PPV主要的非结构蛋白,在PPV复制过程中起着重要作用。本研究中,我们首次验证了 NS1在细胞核和细胞质之间的动态穿梭,尽管其亚细胞定位主要出现在细胞核中。NS1在283-291和602-608氨基酸处有两个核输出信号(nuclear export signal,NES),分别命名为NES1和NES2。NES1和NES2是功能性和可转移的NES,其核输出活性被leptomycin B阻断,说明NS1是通过CRM1途径出核的。此外,截短和缺失突变分析表明NS1在256-274氨基酸处含有一个双分型的核定位信号(nuclear localization signal,NLS)。免疫共沉淀试验表明NS1与核输入受体蛋白α5和α7有相互作用。核质穿梭蛋白的特性是既具有NES又具有NLS,因此我们通过NS1动力学及异核体试验进一步证实了 NS1是一个核质穿梭蛋白。


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