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Q型烟粉虱烟草铵合成酶水平转移基因的鉴定及功能研究

徐海峰  
【摘要】:烟粉虱Bemisia tabaci(Hemiptera:Aleyrodidae)是一种世界性的入侵害虫,因其广泛传播,危害严重,防治困难,对农业生产造成重大损失。目前烟粉虱多种营养获取方式已有报道,但对金属离子的获取机制尚不清楚,借助前期烟粉虱基因组测序分析,我们筛选到可能具有烟草铵合成酶功能的BtNAS,鉴于其在植物和微生物中的广泛研究以及金属离子对昆虫发育的重要作用,我们进行了BtNAS来源和功能的研究。1.验证了BtNAS克隆及水平转移事件我们利用Q型烟粉虱转录组基因组数据对BtNAS进行预测和鉴定,同源序列进化树分析,排除植物和内共生菌的污染的影响,确定BtNAS来源于植物并且通过某种机制嵌入到烟粉虱基因组内。2.BtNAS表达谱研究我们对BtNAS在Q型烟粉虱不同部位(头胸腹)不同龄期(卵,1-4龄若虫,成虫)以及不同离子(铁,锰,铜,锌)和不同Zn~(2+)离子浓度环境下进行表达量测定,发现BtNAS在烟粉虱成虫和腹部高表达,且对食物中Zn~(2+)离子产生响应;由此我们进一步探寻Zn~(2+)处理下的表达响应;梯度Zn~(2+)离子浓度(0,0.2,0.4,0.8,1.0,1.5,2.0,4.0g/L)处理一天后发现BtNAS在不同浓度Zn~(2+)离子浓度条件下存在响应变化,无Zn~(2+)离子条件下表达量下调30%,随着Zn~(2+)离子浓度升高表达量最高上调至1.5倍;为了进一步验证结果的可靠性,我们进行1-3d的离子处理发现结果前后一致,说明BtNAS的表达受高浓度Zn~(2+)离子的诱导,受离子缺失条件抑制。3.BtNAS原核表达与体外功能研究首先通过基因克隆构建了BtNAS-PET30表达载体,导入大肠杆菌感受态细胞,进行体外原核表达。IPTG诱导后发现大部分BtNAS存在于包涵体中;通过破除包涵体,标签蛋白分离纯化获得可溶性BtNAS;通过液质联用鉴定的酶活反应产物,发现产物中具有与NA相同的分子离子峰。证明BtNAS能够在体外合成烟草铵,表明其具备与植物和细菌相似的烟草铵合成酶的功能。4.RNA干扰技术(RNAi)及体内功能研究我们对BtNAS进行RNAi处理后发现其表达量显著下调,并且在连续干扰4d后导致烟粉虱积累的Zn~(2+)和Co~(2+)的含量下降;结合RNAi和生物测定,我们发现烟粉虱在Zn~(2+)离子过量条件下,干扰组死亡率较对照组显著上升,以上实验结果证明BtNAS参与Zn~(2+)和Co~(2+)在烟粉虱体内的积累,并可能参与烟粉虱对Zn~(2+)离子超耐受过程。


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