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多房棘球蚴感染小鼠肝脏差异表达circRNA筛选及其ceRNA网络构建

李秀荣  
【摘要】:环状RNA(circular RNA,circRNA)是由反向剪接(back-splicing)过程产生的共价闭合环状RNA。具有在真核生物中含量丰富,进化上保守,呈现组织特异性表达,高度稳定,可在神经组织中随衰老而累积等特点。circRNA可以通过竞争剪接方式与其对应的线性RNA产物进行顺式调节。棘球蚴病(echinococcosis)俗称包虫病(hydatidosis/hydatid disease),是由棘球属(Echinocococcus)绦虫的幼虫寄生于人和动物的肝脏、肺脏等组织器官而引起的一种重要的人兽共患寄生虫病。由多房棘球绦虫(E.multilocularis,Em)的幼虫即多房棘球蚴引起的疾病称多房棘球蚴病(alveolar echinococcosis,AE)又名泡型棘球蚴病或泡型包虫病,是一种广泛分布于北半球的人兽共患寄生虫病,为自然疫源性疾病。每年大约新增患者17,400例,其中大部分发生在中国。多房棘球蚴可以寄生于中间宿主的肝、肺等组织器官,像恶性肿瘤一样,从组织器官向体腔内蔓延生长,故多房棘球蚴病又称为“虫癌”。它危害宿主的方式主要是通过夺取宿主营养物质、机械性损伤宿主组织器官,对宿主的毒性作用,宿主机体对其产生慢性免疫反应和炎症反应等。同时,因为患者早期无明显的临床症状,所以此类疾病的早期诊断比较困难。研究多房棘球蚴感染小鼠肝脏组织早期特异性或差异性表达circRNA及其ceRNA(competing endogenous RNAs,内源竞争性RNA)网络,旨在为进一步揭示多房棘球蚴感染后引起宿主体内circRNA的变化趋势及探索作为疾病诊断、预后的稳定而灵敏的新型分子生物学标志物的潜力,阐明circRNA的功能与分子作用机制,以及为提高多房棘球蚴病的诊疗水平等奠定基础和提供依据。本论文的主要研究内容和结果如下:1.通过对感染多房棘球蚴小鼠肝脏和未感染小鼠肝脏组织的高通量测序与分析比较,筛选差异表达的circRNA。经生物信息学分析筛选出差异表达的circRNA,根据丰度较高及差异倍数大的原则,选择4个上调表达的circRNA和2个下调表达的circRNA,通过qRT-PCR(quantitative real-time PCR,实时定量PCR)验证其表达趋势是否与高通量测序结果一致,RT-PCR(reverse transcription PCR,反转录PCR)后的Sanger测序验证靶标circRNA的环化位点是否正确。测序结果,上调表达的circRNA基因有201个,下调表达的circRNA基因有9个,差异表达共计210个,实时荧光定量PCR验证出4个上调和2个下调差异circRNA的变化趋势与芯片结果一致。验证出6个差异表达的circRNA,证明高通量测序结果是可信的。利用Sanger测序验证出1个circRNA的剪切位点是合适的。2.对筛选的差异表达circRNA进行生物信息学分析,构建circRNA的circRNA-miRNAmRNA互作网络,体现circRNA的ceRNA的作用机制。差异表达circRNA的GO(Gene Ontology,基因本体论)富集分析显示,在分子功能、生物过程及细胞组分均有富集;KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,京都基因与基因组百科全书)富集通路分析表明,有内吞作用、SNARE蛋白相关囊泡运动、矿物质吸收等与免疫相关的信号通路。基于芯片qRT-PCR验证结果,采用生物信息学方法,分析感染多房棘球蚴小鼠和对照组肝脏差异表达的circRNA可能结合的miRNA,从circRNA调控的角度探讨多房棘球蚴在宿主体内可能的致病机制。最后,构建了5个候选circRNA分子的circRNA-miRNA-mRNA网络图,为下一步深入研究多房棘球蚴感染宿主中差异表达的circRNA相关功能提供了重要线索。综上所述,本研究初次进行多房棘球蚴感染宿主的circRNA高通量测序,初步探索了circRNA在感染早期发生的变化。验证芯片测序结果可信,确定了2个circRNA的剪切位点,对5个候选circRNA进行了ceRNA可能作用网络的分析,探讨其可能作用的靶分子,为今后深入研究circRNA在宿主多房棘球蚴病致病中的作用与分子机制等奠定前期基础和提供参考依据。


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