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牦牛不同发育时期背最长肌转录组和全基因组甲基化分析

马晓明  
【摘要】:牦牛作为生活在高原上的畜种之一,其肉产品具有高蛋白、低脂肪、富含各类不饱和脂肪酸等优点,但其特殊的生存环境和长达7个月的枯草期,使其生长和增重出现波浪式消长。而骨骼肌的发育是牦牛增重和遗传选育的关注点。本研究利用转录组测序(RNA-seq)、甲基化修饰依赖性内切酶测序(Methyl-RAD)、实时荧光定量PCR(Q-pcr)、蛋白质免疫印迹(Western blot)、基因克隆、细胞培养等现代生物技术进行了两个方面的试验研究:一、研究了牦牛在不同生长时期时的骨骼肌蛋白编码RNA(mRNA)和长链非编码RNA(LncRNA)在全基因组水平上的表达变化、DNA甲基化水平变化,初步探究了DNA甲基化对肌肉生长的调控机制,并根据蛋白编码RNA和DNA甲基化数据寻找到六个影响肌肉发育的关键基因。二、研究了与肌肉生长发育相关的两个基因(RXRA和BIN1)在小鼠成肌细胞C2C12分化过程中表观转录调控模式。为研究牦牛肌肉发育的及产肉性状候选基因的筛选和鉴定提供了参考依据。主要研究内容和结果如下:1.对牦牛背最长肌在不同发育时期差异蛋白编码基因进行分析,设定阈值为|log2FC|1.2,padj0.01,结果表明:在6月龄和胎牛比较组中(M-vs.-E)共筛选出7079个差异表达基因;在六月龄和成年比较组共(M-vs.-A)筛选出1237个差异表达基因;在成年和胎牛比较组(A-vs.-E)共筛选出6401个差异表达基因。其中在M-vs.-E比较组中有3096个上调和3983个下调基因,M-vs.-A比较组中有517个上调和720个下调基因,A-vs.-E比较组中有3017个上调和3348个下调基因。2.根据分析蛋白编码RNA数据结果发现,共有381个属于三个比较组的共表达差异表达基因。并对上述筛选出的基因进行功能注释,发现许多GO条目和KEGG通路与能量代谢、肌细胞分化、脂肪沉积有关。例如GO:0014706(横纹肌组织发育);GO:0030049(肌肉细丝滑动);GO:0003012(肌肉系统过程);GO:0006941(横纹肌收缩);GO:0043292(弹性纤维);GO:0042692(肌肉细胞分化);GO:0060537(肌肉组织发育);GO:0001666(对缺氧的反应);bom04068(FoxO信号通路);bom04530(紧密连接);bom01100(代谢途径);bom03320(PPAR信号通路);bom00561(甘油脂代谢)和bom04010(MAPK信号通路)。3.利用MethyI-RAD技术对牦牛背最长肌进行全基因组甲基化测序,系统绘制出牦牛背最长肌在不同发育时期的甲基化图谱,寻找到一些影响肌肉发育的关键差异甲基化区域。通过蛋白编码RNA与差异甲基化启动子区域数据联合分析,确定RXRA、IGF2、MUSTN1、BIN1、TMEM8C和CACNA1S基因启动子区域甲基化程度与基因表达呈负相关,初步认为其表达可能受到DNA甲基化水平的调控。4.通过RNA测序分析牦牛骨骼肌发育过程中LncRNA的表达模式,共鉴定出1180个LncRNA(已知435个,新745个)。设定阈值为|log2FC|1.2,padj0.001,A vs.E组共有差异表达LncRNA 284个(其中上调154,下调30);M vs.A组共有差异表达LncRNA 60个(其中上调31,下调29);M vs.E组共有差异表达LncRNA 296个(其中上调147,下调149)。并依据差异表达LncRNA顺反调控靶基因进行GO和KEGG数据库的功能注释分析表明,差异表达的Lnc RNA主要参与PI3K-Akt signaling(PI3K-Akt信号通路)、Rap1 signaling(Rap1信号通路)、regulation of lipolysis in adipocytes(脂肪细胞脂解调控)、FoxO signaling(FoxO信号通路)和p53 signaling(p53信号通路)。此外,RTL1、IGF2、MEF2C、Pax7等肌肉发育调控因子也被纳入到差异表达靶基因和LncRNA的共表达网络中。这些数据将有助于进一步阐明LncRNA在牦牛骨骼肌发育不同阶段的功能。5.根据蛋白编码mRNA转录组与全基因组甲基化数据结果得到的候选基因,从中选择RXRA和BIN1两个关键基因在小鼠成肌细胞系中验证,发现其表达量与启动甲基化程度成反比,说明上述两个基因在成肌细胞C2C12中的表达受到启动子区甲基化程度的影响。本次试验研究结果显示,在牦牛不同发育时期的肌肉组织中存在大量DNA甲基化修饰和mRNA/LncRNA表达差异的基因,这些差异基因主要与肌肉细胞的生长分化和代谢相关;在细胞和个体水平上鉴定了与肌肉生长发育相关的功能基因RXRA和BIN1,研究这两个关键基因在细胞水平的启动子甲基化调控作用,从而系统地从遗传和表观遗传调控等方面揭示与肌肉生长发育相关基因的功能与分子调控机制,这不仅对全方位阐明牦牛肉用性状遗传和调控的分子机理具有重要科学意义,而且为牦牛肉用选育和高效生产提供科学理论依据。


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