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MHC单倍型鸭胚肝间充质干细胞的建立及应用

佟相慧  
【摘要】:为了解决多种鸭病病毒没有适合的传代细胞系的现实问题,本论文利用无特定病原体(Specific pathogen free,SPF)鸭开展了鸭胚肝间充质干细胞(Duck embryo liver mesenchymal stem cells,Du LMSC)的研究。抗原相关转运体(Transporter associated with antigen processing,TAP)基因(Tap1和Tap2)和主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex,MHC)I类分子重链编码基因(UAA)位于鸭MHC的核心区域,且位置比邻。本研究测定了Tap1和Tap2序列纯合的4个鸭品系(B1、B2、B3和B4)的UAA编码区序列,确定了各品系内UAA序列同源。利用此4个品系,采用Ⅳ型胶原酶消化法从鸭胚肝脏中分离DuLMSC,体外可传代培养至50代。细胞形态稳定呈长梭形贴壁生长,不表达造血干细胞分子标记,能够向成骨细胞和成脂细胞分化,且前35代细胞对裸鼠无致瘤性。将4个细胞株,分别命名为DuLMSC/1、DuLMSC/2、DuLMSC/3和DuLMSC/4。为比较鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus,DEV)对4个细胞株的适应性,我们将DEV C-K CE株分别接种到4个细胞株上并连续传10代。结果显示F1至F10代病毒接种细胞后,均产生典型的细胞病变(Cytopathic effect,CPE);F1至F10代病毒均能特异性地扩增出DEV的UL2基因片段,且F1、F5和F10代病毒的UL2基因核苷酸序列与原种毒完全同源;接毒24 h的细胞的细胞浆、细胞核和细胞间隙内存在典型的疱疹病毒样粒子;DEV在4个细胞株上的一步生长曲线表明DuLMSC/4上的各个时间点对应的病毒滴度都高于或接近其他3个细胞株;另外,F1至F10代的病毒滴度从F5代开始趋于稳定,Du LMSC/3或DuLMSC/4上的病毒滴度比DuLMSC/1或Du LMSC/2高约0.5个TCID50,且在4个细胞株上前五代的病毒滴度平均值始终比在CEF细胞上高0.5个TCID50左右。在分析鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus,DHAV)1型弱毒株和DHAV-3弱毒株对D uLMSC/4的适应性时,DHAV-1连续传代至F8代时产生CPE,F1至F15代病毒均能特异性地扩增出DHAV-1的3D基因片段且F1、F7和F15代的3D基因核苷酸序列与原种毒完全同源;DHA V-3连续传代至F3代时产生CPE,F1至F15代病毒均能特异性地扩增出DHAV-3的VP1基因片段且F1、F7和F15代的VP1基因核苷酸序列与原种毒完全同源。病毒增殖曲线结果显示DHAV-1核酸相对拷贝数范围为1-30,而DHAV-3核酸相对拷贝数在10-120之间。利用B3系鸭UAA部分α2和完整α3区的大肠杆菌表达产物制备了鸭MHC I类分子特异性鼠源单抗G1。G1的重链为IgM,轻链为Kappa型。G1对B4鸭外周血细胞和对SPF白来航鸡外周血细胞的流式细胞术检测结果分别为70.3%和19.4%。DEV感染Du LMSC/4后,细胞表面MHC I类分子的表达量先下调后上调,而细胞内MHC I类分子转录水平始终上调,推测DEV感染早期能抑制MHC I的递呈。本研究建立的DuLMSC/4,能支持DEV和DHAV增殖,能用于MHC I相关的基础研究,是鸭病防控技术研发的良好实验材料。


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