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细胞色素P450介导B、Q烟粉虱药剂敏感性差异的分子机制

何超  
【摘要】:烟粉虱Bemisia tabaci是一种世界性重大农业害虫,常年危害造成农作物减产30-50%,甚至毁种绝收。实验室长期监测结果发现,Q烟粉虱已经取代先前占据主要生态位的B烟粉虱,证实杀虫剂使用是导致Q烟粉虱取代B烟粉虱的关键生态机制,同时生化研究表明Q烟粉虱P450解毒酶活性显著性高于B烟粉虱。在此基础上,本研究从烟粉虱P450家族基因入手,运用生理生化、细胞生物学和毒理学的研究手段,最终揭示P450基因介导B、Q烟粉虱药剂敏感性差异的分子作用机理。主要研究结论如下:1.B、Q烟粉虱P450家族基因序列差异及进化特点:明确B、Q烟粉虱P450基因的数量分别为166和158条,分为4个Clans;系统发育树结果表明,与褐飞虱相比,B、Q烟粉虱P450基因Clan 3和Clan 4存在明显扩张,这可能与B、Q烟粉虱世界性范围分布且强的环境适应性有关。2.B、Q烟粉虱P450基因对吡虫啉响应差异:q PCR结果表明,吡虫啉药剂处理后,对于Q烟粉虱,一共有14个P450基因的表达量要高于B烟粉虱(CYP6JK1,CYP6DZ8,CYP6DZ9,CYP6DZ3,CYP6DW4,CYP6CM1,CYP4CS12,CYP4G128,CYP3133D4,CYP3133E1,CYP3133D3,CYP3133E8,CYP301A1,CYP18A1),这些差异基因作为后续功能研究的靶标基因。3.B、Q烟粉虱田间种群P450表达量差异比较:q PCR结果发现,3个田间Q烟粉虱种群中有9个P450基因同时都高表达(CYP6CM1,CYP6EM1,CYP6DV5,CYP6CX3,CYP4CS5,CYP4CS12V2,CYP3133E4,CYP3133C1,CYP301B1),然而,在田间B烟粉虱种群中,在这9个P450基因之中,只有CYP6CM1基因表达量高于室内种群,并且CYP6CM1基因表达量显著性低于Q烟粉虱,表明这9个P450基因可能介导B、Q烟粉虱药剂敏感性的差异。4.RNA干扰P450基因后对B、Q烟粉药剂敏感性差异的影响:在前期P450基因筛选基础上,结合P450基因家族作用特点,开展9个P450 6家族基因的RNAi功能研究(CYP6JK1,CYP6DZ8,CYP6DZ9,CYP6DZ3,CYP6DW4,CYP6CM1,CYP6EM1,CYP6DV5,CYP6CX3)。结果表明,干扰这9个P450基因后,Q烟粉虱的死亡率显著上升,而B烟粉虱只有干扰CYP6CM1后,死亡率才上升,表明这8个P450基因可能在B、Q药剂敏感性差异中起作用。5.NADPH细胞色素P450还原酶(CPR)研究:本研究通过PCR、RNAi、体外表达和酶活性实验研究Q烟粉虱CPR功能,结果表明,Bt CPR可能会影响烟粉虱Q对吡虫啉的敏感性。6.体外P450蛋白表达以及代谢实验验证:差光谱结果表明,成功表达了8个P450基因,进一步代谢实验表明,只有CYP6CM1能够代谢吡虫啉;研究结果验证了CYP6CM1不仅在烟粉虱抗吡虫啉机制中起着关键作用,而且在B、Q烟粉虱对杀虫剂的敏感性差异中也可能起到作用。7.B、Q烟粉虱CYP6CM1多态性检测:田间Q烟粉虱种群中,CYP6CM1基因具有42种多态性,而在B烟粉虱中,CYP6CM1基因只有12种多态性,表明CYP6CM1基因的多态性可以影响B、Q烟粉虱药剂敏感性差异。


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