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不同铁源对原代培养肉鸡鸡胚肝细胞含铁关键酶活性及其基因表达的影响

马雪莲  
【摘要】:本论文通过3个试验,研究了不同铁源及铁水平对体外原代培养肉鸡鸡胚肝细胞铁含量、含铁关键酶活性及其基因表达以及铁蛋白基因表达的影响,从细胞及分子水平探讨了不同铁源在肉鸡肝细胞中代谢利用的机制。试验一旨在成功构建稳定、可靠的肉鸡胚肝细胞原代培养模型,为下一步不同水平铁和不同形态铁的试验奠定基础。选用健康的14胚龄爱拔益加(AA)肉鸡鸡胚为本试验的细胞供体,Leibovitz’s L-15培养液为基础培养液进行体外培养。结果表明:分离的肝细胞纯度较高、分化完全、功能健全,细胞活力好;细胞形态学、培养液乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)活性及MTT细胞持续活力结果基本相一致,即肝细胞原代培养细胞活力保持最佳的时间范围是在细胞培养的第3至6天。本试验成功建立了肉鸡鸡胚肝细胞原代培养模型,可用于后续的试验。试验二是在试验一的基础上,研究探讨了不同水平无机铁在不同孵育时间下对原代培养肉鸡鸡胚肝细胞铁含量、含铁关键酶活性及其基因表达以及铁蛋白基因表达影响,确定了鸡胚肝细胞培养最适的铁添加水平和铁作用时间,为下一步不同形态铁源的试验奠定基础。本试验采用5×3两因子完全随机设计,以硫酸亚铁(FeSO_4·7H_2O)为无机铁源,设置5个铁添加水平分别为0(对照)、0.25、0.5、0.75、1.00 mmol/L,以及3个细胞孵育时间分别为24、48和72 h,共组成共15个处理组,每个处理6个重复。结果表明:(1)孵育24、48和72 h时,肝细胞铁含量随着添加铁水平的升高而呈线性或二次曲线趋势升高(P0.05),过氧化氢酶(catalase,CAT)活性呈现二次曲线形式升高(P0.05),细胞色素c氧化酶(cytochrome c oxidase,COX)活性呈现线性变化(P0.05),琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase,SDH)活性则随孵育液中铁添加水平的升高而呈线性或二次曲线形式下降(P0.01);在铁添加水平为0.25或0.50 mmol/L、孵育时间为24 h时,肝细胞铁含量、CAT、SDH及COX活性均显著高于其他处理组(P0.05)。(2)随着添加铁水平的升高,肝细胞SDH及FTH1 mRNA表达呈线性升高(P0.05),而CAT及COX7A2L mRNA表达呈线性或二次曲线形式升高(P0.05);孵育24、48及72 h时,与不添加铁组相比,添加0.50、0.75及1.00 mmol/L铁显著提高了COX1的mRNA水平(P0.05)。(3)随着铁添加水平的升高,肝细胞CAT、SDH及COX1的蛋白表达均呈线性升高(P0.05);孵育24与72 h后的肝细胞SDH蛋白表达显著高于48 h(P0.05);孵育24、48及72 h,添加铁均显著提高了FTH1的蛋白表达(P0.05)。综合以上结果,在提高肝细胞铁含量、以上含铁酶活性及其基因表达以及FTH1基因表达方面,较适宜的铁添加水平为0.25或0.5 mmol/L,孵育时间为24 h。试验三是研究不同形态铁源对原代培养肉鸡鸡胚肝细胞的铁含量、含铁关键酶活性及其基因表达以及铁蛋白基因表达的影响,进一步探讨了不同形态铁在鸡胚肝细胞中代谢利用的差异及其机制。本试验采用4?2+1两因子完全随机设计,设置4种铁源,分别为硫酸亚铁(FeSO_4·7H_2O)、弱络合强度的蛋氨酸铁(Fe-Met W;Q_f=1.37)、中等络合强度的蛋白铁(Fe-Prot M;Q_f=43.6)和极强螯合强度蛋白铁(Fe-Prot ES;Q_f=8.59?10~3);两个铁添加水平分别为0.25和0.50 mmol/L,另设一个不添加铁的对照组,共组成9个处理组,每个处理6个重复。结果表明:(1)与对照组相比,添加铁显著提高了肝细胞铁含量(P0.05);添加FeSO_4·7H_2O、Fe-Met W及Fe-Prot M组的肝细胞铁含量显著高于Fe-Prot ES组(P0.05),但FeSO_4·7H_2O、Fe-Met W及Fe-Prot M组间差异不显著(P0.05);与添加0.25 mmol/L铁组相比,添加0.5 mmol/L铁显著提高了肝细胞铁含量(P0.05)。(2)与对照组相比,添加铁对肝细胞SDH、CAT及COX活性无显著影响(P0.05);添加铁源、铁水平及铁源与水平间的互作也未对肝细胞SDH、CAT及COX活性产生影响(P0.05)。(3)与对照组相比,添加铁显著提高了肝细胞CAT、SDH及FTH1的mRNA表达水平(P0.05);添加0.50 mmol/L铁组肝细胞的CAT mRNA水平显著低于添加0.25 mmol/L铁组(P0.05),但其FTH1mRNA水平却显著高于添加0.25 mmol/L铁组(P0.05);添加Fe-Prot M和Fe-Met W组肝细胞的SDH mRNA表达水平显著高于添加Fe-Prot ES和FeSO_4·7H_2O组(P0.05),而添加Fe-Met W与Fe-Prot M组间及FeSO_4·7H_2O与Fe-prot ES组间均无显著差异(P0.05)。(4)与对照组相比,添加铁显著降低了肝细胞CAT和SDH的蛋白表达(P0.05),显著提高了COX1和FTH1的蛋白表达(P0.05),且添加0.25 mmol/L铁组的FTH1蛋白表达显著高于添加0.50 mmol/L铁组(P0.05)。但添加铁源、铁水平及两者的互作对肝细胞CAT、SDH、COX1的蛋白表达均未产生显著影响(P0.05)。综上所述,添加无机铁可在转录和翻译水平上直接正调控肉鸡鸡胚肝细胞中CAT、COX1和FTH1的基因表达;在提高肝细胞铁含量方面,中等和弱络合强度有机铁及无机硫酸亚铁优于极强螯合强度有机铁,而在提高肝细胞的SDH mRNA水平方面,中等和弱络合强度有机铁优于极强螯合强度有机铁和无机硫酸亚铁,提示极强螯合强度有机铁可能因其螯合键太强而不易释放利用,故其在肉鸡鸡胚肝细胞中的代谢利用性不如弱和中等络合强度有机铁。以上研究新成果可为阐明不同形态铁在肉鸡肝细胞内的代谢利用及其分子机制提供科学试验依据。


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