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甲型流感病毒NP蛋白抗原捕获ELISA检测方法的建立

徐菱  
【摘要】:甲型流感病毒(Influenza A virus,IAV)是一种高度传染性的呼吸道病原体,其季节性流行和大流行导致全世界范围内的人和动物的发病和死亡,对全球公共卫生安全、经济发展和社会稳定造成巨大的威胁。流感病毒可以通过易感动物的唾液、鼻腔分泌物、粪便和血液传播。流感的常见症状是发烧、头痛、咳嗽等。近年来流感频发,严重威胁公共卫生安全,所以建立通用型甲型流感病毒方便、快速、准确的检测方法,对于甲型流感的跨物种传播、临床诊断以及流行病学研究具有重大意义。IAV的核糖核蛋白(Nucleoprotein,NP)富含精氨酸、甘氨酸和丝氨酸残基,是由流感病毒基因组中第5片段RNA所编码的,分子量约为56 KDa,是高度保守的结构蛋白,不同宿主分离的病毒株最大氨基酸差异小于11%。A型、B型和C型流感病毒NP基因也存在显著的相似性。NP蛋白含有各亚型流感病毒共有的抗原表位,可诱导产生交叉反应抗体和T细胞反应,为CD8~+T细胞主要识别的内部病毒抗原,常用于流感病毒免疫诊断和新型流感病毒疫苗的研究开发。本研究将马流感病毒H3N8_(XJ07)株和人类甲型流感病毒H1N1_(SC09)株中高度保守的NP蛋白克隆到真核表达质粒中,利用真核表达系统纯化NP蛋白,采用先免疫含NP基因的重组质粒后免疫真核表达的NP蛋白的免疫程序,制备甲型流感病毒NP蛋白单克隆抗体(Monoclonal Antibodies,MAb)。通过间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,经过3次细胞亚克隆后,H3N8_(XJ07)和H1N1_(SC09)共获得21株能稳定分泌抗体的阳性单克隆细胞。之后构建H1N1_(SC09)NP分段突变体,通过免疫印迹试验筛选到3种可以识别NP蛋白不同氨基酸片段的抗体。挑选出3株单克隆细胞(XJ07-4、SC09-6、SC09-12)进行扩大培养。通过对3株MAb和反应条件的优化,以SC09-6作为捕获抗体,XJ07-4作为检测抗体,建立了检测甲型流感病毒NP蛋白的抗原捕获ELISA检测方法。该检测方法捕获抗体浓度为2 mg/mL,0.1μg/孔,检测抗体浓度为1mg/ml,0.05μg/孔,NP蛋白浓度在6.07 ng/mL~101.57 ng/mL时与OD_(450nm)呈良好的线性关系,相关系数R2﹥0.99。通过特异性、广谱性、灵敏度、重复性试验评价该抗原捕获ELISA方法。结果显示:该抗原捕获ELISA方法可以特异性的检测甲型流感病毒,与乙型流感病毒、新城疫病毒、马传染性贫血病毒、马疱疹病毒、马动脉炎病毒均无交叉反应;可以广谱性检测甲型流感病毒的多个亚型;与血凝试验相比,该抗原捕获ELISA方法具有很高的灵敏度,可以检测到20 ng/mL的病毒NP蛋白;批内和批间重复性变异系数均小于8%;与RT-PCR方法相比符合率为71.43%。综上所述,本研究建立的甲型流感病毒NP蛋白抗原捕获ELISA检测方法通用性强、特异性好、灵敏度高、重复性好,可用于多种宿主的甲型流感病的快速诊断,也可为NP蛋白功能研究及定量检测提供技术支持。


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