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伪狂犬病病毒变异株和经典株神经传导和毒力差异的研究

吴红霞  
【摘要】:伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染多种家畜和野生动物的以发热、奇痒及脑脊髓炎为主要症状的一种急性传染病。PRV基因组全长约143 kb,对其进行改造和修饰比较困难。本研究成功构建了我国PRV经典毒株SC株的fosmid文库,该文库涵盖了 PRV SC株完整基因组序列的重组质粒共200多个,从中优选了能高效拯救病毒的5种组合,共13个质粒。将PRV SC株的fosmid文库质粒转染Vero细胞,5~7 d内即可成功拯救出重组病毒,拯救出的病毒与亲本毒株体外生物学特性一致。将该fosmid文库结合Red/ET所介导的同源重组技术,可对PRVSC基因组进行精准编辑。应用该技术构建了在PRVSC的UL36基因N端插入EGFP报告基因的重组病毒rPRVSC-UL6-EGFP。与亲本毒相比,该重组病毒的生物学特性和对小鼠的致病性没有显著变化。应用该重组病毒能有效示踪PRV单个病毒粒子感染神经元的入侵、传导、复制和释放各个阶段。与PRV经典株SC相比,变异株TJ对小鼠的致病力更强,对小鼠的半数致死剂量(LD50)更低,表现出更为严重的瘙痒症状。进一步研究证实,PRVTJ株对神经细胞的入侵效率明显高于SC株。由于两个毒株的与PRV入侵有关的gB、gC和gD蛋白存在突变,本研究利用PRV TJ和PRV SC株的fosmid文库构建了一系列gB、gC和gD基因替换重组病毒,通过比较重组病毒对神经细胞N2a细胞的吸附和内化效率,证实gB、gC和gD蛋白的突变不同程度地增强了 PRVTJ株的吸附效率,gB和gD蛋白的突变增强了 PRV变异株的内化效率。其中gD蛋白对内化的影响较gB更显著,gC不直接参与内化过程,但可通过改变病毒细胞吸附能力影响内化效率。在小鼠上评价了gB、gC和gD同时替换后的重组病毒致病性,结果证实,TJ株替换了SC的gB、gC和gD蛋白后,其LD50与亲本毒PRV SC的一致,反过来SC株替换了 TJ的gB、gC和gD蛋白后,重组病毒的LD50与亲本毒PRV TJ一致,小鼠瘙痒症状也发生相应的改变,说明入侵相关蛋白的突变改变了 PRV的致病力。总之,本研究成功构建了 PRV SC株的fosmid文库,应用该文库能够快速高效地完成PRV重组病毒的构建;利用微流体系统成功示踪了PRV单个病毒粒子在神经轴突中的运动过程。这为研究不同PRV毒株神经嗜性和神经传导特征以及在神经元轴突转运机制等提供了技术保障。另外,gB、gC和gD蛋白的突变的协同作用使得PRVTJ株对神经细胞入侵效率提高和对小鼠致病性增强,其中gD蛋白突变是入侵效率提高的主要因素。这为PRV变异株致病力增强机制研究和疫苗研制提供重要理论基础。


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