基于多组学的放牧和舍饲羊肉鉴别方法与机制研究

【摘要】：饲养方式是影响羊肉品质的关键因素,已有相关研究表明不同饲养方式可以使羊肉中的脂肪沉积及风味物质含量产生差异。随着生活水平的提高,人们在选购过程中会更倾向于放牧羊肉。一些不法经营者为了提高销量,牟取利润,会将舍饲羊肉冒充高品质放牧羊肉进行销售,这一行为不仅侵犯了消费者权益,而且使放牧羊肉产业受到冲击,发展受阻。为了实现优质优价,促进优质产业发展,针对不同饲养方式的羊肉开发一种有效鉴别方法十分必要。目前羊肉真伪鉴别研究热点主要集中在产地鉴别、品种间掺假鉴别方面,而针对不同饲养方式羊肉的鉴别鲜有报道。本文采用代谢组学和脂质组学方法对不同饲养方式羊肉中的小分子代谢物进行分析,筛选差异代谢物作为标志物,建立稳定可靠的判别模型,同时借助转录组学对代谢物上游涉及的调控机制进行探讨,实现组学间的相互验证,从而为羊肉品质的提升提供基础依据。主要研究内容及结果如下:建立了羊肉中极性和非极性代谢物的前处理方法及基于UHPLC-QTOF-MS的非靶向代谢组学和脂质组学检测方法,对85份放牧羊肉和53份舍饲羊肉进行检测,采用多元统计分析方法对放牧和舍饲羊肉中的代谢轮廓进行表征,筛选差异代谢物构建判别模型,并使用实际样品对模型进行了验证。结果表明在非靶向代谢组学和脂质组学研究中,放牧羊肉和舍饲羊肉在无监督主成分分析中均具有较好的分离度,随后基于有监督的正交偏最小二乘判别分析模型,以P0.05、FC1.2 or0.83和VIP1为阈值筛选差异标志物。在非靶向代谢组学正离子模式下初步定性出15个生物标志物,其中有12个标志物借助标准品进行了准确定性。负离子模式下初步定性出10个生物标志物。在非靶向脂质组学正离子模式下初步定性出20个生物标志物,负离子模式下初步定性出5个生物标志物。根据文献中报道的质谱裂解特征对筛选出的脂类标志物的结构进行了解析。基于正离子模式下获得的差异标志物构建判别模型,并采用59份实际样品进行验证,非靶向代谢组学和脂质组学的正确判别率分别为89.83%和98.31%。这些差异物在肉类的风味、口感、持水力、颜色、缓冲及抗氧化方面具有重要作用,影响羊肉的营养品质。在非靶向组学基础上,针对15种极性代谢物和20种非极性脂类代谢物建立了LC-MRM-MS的靶向代谢组学分析方法,对放牧和舍饲羊肉进行检测,同时采用溶剂标对12种极性代谢物进行了相对定量,随后进一步选择预测能力强的差异物构建模型,并采用实际样品进行了验证。结果表明,靶向方法检测的这些差异物能够在非监督分析中很好的区分放牧和舍饲羊肉。通过ROC分析,选择预测能力强的代谢物,靶向代谢组学选择出11个标志物,靶向脂质组学选择出6个标志物,分别采用实际样品对模型进行验证,正确判别率分别为89.83%和100%,具有较好的判别能力。为了更好的反映不同饲养方式羊肉基因转录到下游代谢的整体情况,实现数据的互补,更加完整地阐释不同饲养方式羊肉差异代谢物背后涉及的多代谢通路的复杂调控机理,借助高通量RNA-seq技术对不同饲养方式羊肉组织进行转录组测序,筛选差异表达基因,进行功能注释及代谢通路富集分析,随后与代谢组学和脂质组学进行联合分析。结果表明,以阈值p-adjusted0.01和Log_2(FC)2.32或-2.32为筛选条件,在放牧和舍饲羊肉两组样本间共筛选出162个差异基因,其中50个上调,112个下调。差异基因KEGG显著富集在AMPK信号通路、PI3K-Akt信号通路等pathway中,而差异代谢物初步预测了33条通路。通过联合分析锁定了一些关键的差异基因和代谢物参与的重点通路,这些差异代谢物和差异基因之间存在复杂的调控关系,是不同饲养方式羊肉营养品质产生差异的重要原因。