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Xenorhabdus bovienii A54菌株杀虫物质的研究

王立霞  
【摘要】: 昆虫病原线虫共生细菌寄生于昆虫病原线虫肠道内,二者互惠共生。该 菌对昆虫有很强的致病力,大部分共生菌注射到昆虫血腔内,LD_(50)仅为1-10 个活细胞。Bowen(1998)首次报道Photorhabdus luminescens的W-14菌 株能产生对昆虫有胃毒活性和血腔毒性的杀虫蛋白,这一结果引起了国际学 者对共生细菌的关注,因此有关该菌杀虫物质及其杀虫机制的研究日益成为 国际研究的热点。我国对昆虫病原线虫的研究较多,但对其共生菌的研究十 分薄弱,有关共生菌杀虫物质的研究在国内尚属空白。 本研究选取有代表性的11个菌株为实验材料,提取其胞外杀虫物质, 检测胃毒活性和血腔毒性,筛选得到采自我国的Xenorhabdus bovienii A54 菌株为高毒力的菌株。论文首次在国内外对X.bovienii产生的大分子胞外杀 虫物质及其特性进行研究,该项目的研究可以提供新的杀虫资源,为杀虫物 质的开拓作出贡献;同时这一研究也有助于揭示共生细菌的致病机制。现将 主要研究结果总结如下: 1.比较研究了11个菌株胞外分泌物的杀虫活性。结果表明,不同菌株产生 的杀虫毒素不同;其中5个菌株能同时产生血腔和胃毒两种毒素,3个菌 株只产生血腔毒素,3个菌株既无血腔毒素又无胃毒素的产生。另外,不 同菌株杀虫毒素致病力强弱也各不相同:从血腔毒性上看,菌株HZL和 15-2毒性最高,A54、BJ、ALL、CB-8、Meg毒性次之,D43毒性较差; 从胃毒活性上看,A54致死活性最高,BJ、ALL、D43、15-2致死作用弱, 仅对昆虫的生长有抑制作用。 2.筛选出X.bovienii A54菌株为高毒力的菌株。粗提物注射大蜡螟老龄幼 虫,96hr死亡率为93.3%;粗提物饲喂玉米螟和棉铃虫初孵幼虫,120hr 死亡率分别为100%和90.7%。这一结果表明采自我国吉林的A54菌株有 很好的杀虫活性,是很有利用价值的一种细菌资源。 3.从胞外分泌物入手,研究比较A54菌株Ⅰ、Ⅱ型菌产生胞外蛋白的差异, 首次开展共生菌的型态变异同其杀虫活性关系的研究。电泳结果表明,Ⅰ、 中囚农科院博十研究生学位论文 11型的产生的胞外蛋白存在很大差异:11型菌产生的胞外蛋白都能为1型 菌产生,而且1型菌的产生量要高于11型菌:另外,1型菌产生的胞外蛋 H种类也多十*型菌。通过测定1、11型菌胞外产物的杀虫活性,发现1 型菌的胞外产物对昆虫有胃毒活性和血腔毒性,11型菌没有杀虫活性, 这 研究结果为今后本领域研究共生菌胞外杀虫物质的试验方法提出警 小,必须保证实验所用共生细菌不发生型变,否则将无法获得杀虫物质。 4.色谱杜层析的结果表明,菌株M4产生的胃毒素和血腔毒素为两类不同 的杀虫物质:初步鉴定该胃毒素为多糖类物质,这一发现在国内外尚属 首次。对A54胃毒素的研究表明,该毒素可被85%饱和度的硫酸铰沉淀, 个能通过透析膜(截留分子量>10kD)。采用饲喂棉铃虫初孵幼虫的杀虫 活性追踪检测,通过硫酸按盐析、阴离子交换柱层析、阳离子交换柱层 析等方法,对该毒素进行了分离纯化。用红外光谱初步鉴定,该毒素为 多糖类物质。经计算每升发酵液胃毒素的产量约为 1.ling。理化特性分析 表明,该毒素的分子量约为门兀D:在3炉*一80”C范围内杀虫活性稳定: 对氯仿和正丁醇敏感,对甲醇相对稳定;随着胃毒素浓度的提高,棉铃 虫幼虫的死亡率增加,胃毒素对棉铃虫初孵幼虫的致死中浓度为30.08pg/g (胃毒素/饲料)。该毒素对较高龄期棉铃虫幼虫生长有一定的抑制作用。 5.初步研究了胃毒素对棉铃虫的生理效应。通过对棉铃虫解毒酶的活力测 定分析,发现取食胃毒素后,棉铃虫体内。乙酸蔡酯酶的活力增加,乙 酚胆碱酯酶和谷脱甘肽转移酶的活力变化不大,结果说明a-乙酸蔡酯酶 是棉铃虫体内参与胃毒素代谢作用的一种解毒酶。比较对照棉铃虫和取 食胃毒素的感病棉铃虫体内总蛋白的含量,发现感病棉铃虫体内蛋白质 的含量明显卜降。酯酶同工酶的分析结果表明,与对照棉铃虫相比,感 病棉铃虫幼虫酯酶谱带数少,颜色浅,酯酶同工酶的活力减弱。 ︽ 首次从组织病理学的角度研究了胃毒素的杀虫机制。利用光学显微镜观 察棉铃虫幼虫的中肠组织,发现取食胃毒素后,棉铃虫中肠组织发生病 变,围食膜脱落,肠壁细胞逐渐降解,中肠细胞排列疏松混乱。利用电 镜观察中肠细胞的超微结构变化,发现取食胃毒素后,棉铃虫中肠微绒 毛肿胀、变形、脱落,内质网减少,中肠细胞自溶、出现空泡。 5 摘 要 7.研究测定了A54胃毒素与Bt毒蛋白对棉铃虫的交互作用。结果发现随着 棉铃虫/’kJ料中 A54胃毒素和 Bt毒蛋臼浓度的增加,棉铃虫幼虫的死亡率 均显著卜升;方差分析的结果表明二者互有增效作用。这一结果为探索 穴小荫的胞外产物可成为Bt的增效剂提供了佐证。 8.在囚内外召次揭示X bovienii A54菌株能产生对大蜡螟幼虫和棉铃虫幼虫


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