番茄抗叶霉病新基因Cf-ECP3的作图定位和特性分析

【摘要】： 番茄和其真菌病原菌Cladosporum fulvum的互作符合基因对基因 学说。本研究鉴定出一个新的番茄抗叶霉病基因，能够识别病原菌C. fulvum在侵袭番茄叶片时分泌到胞间隙中的胞外蛋白（Extracelluar proteins，ECPs）ECP3，并启动过敏性坏死反应（Hypersensitive response， HR），因此将该抗性基因命名为：Cf-ECP3。在一个由192株组成的F_2 群体内对该抗性基因的分离情况进行分析，发现该抗性是由一个显性 基因控制的。扩增后的限制性酶切多态性标记（Cleaved Amplified Polymorphic Sequences，CAPS）分析进一步将Cf-ECP3精密作图于番 茄第一条染色体短臂上的Orion位点，与一个CAPS标记CT116共 分离。用一个Hcr9(Homologous of Cladosporium resistance gene Cf-9， Hcr9)探针进行的RFLP分析进一步表明，该抗病基因与一个1.6kb的 BglⅡ和一个1.6kb的Sst Ⅰ片段共分离，这个结果暗示了Cf-ECP3可 能象番茄第一条染色体短臂上的其它Cf基因：Cf-4和Cf-9一样属于 Hcr9家族。由于另外一个Cf-ECP2基因也作图定位于Orion位点， 因此Orion位点将是番茄第一条染色体短臂上Milky Way位点之外的 又一个包含有功能Cf基因的复杂的基因座位。 由于对番茄第一条染色体短臂上分布的Hcr9基因簇的结构和组 织形式、Hcr9的进化及新的Cf基因演化机制的兴趣，本研究应用了 依图谱克隆（map-based cloning）和侯选基因（candidate gene）相结 合的策略对Cf-ECP3及该基因所处的Orion基因簇进行克隆分析的探 索。构建了一个含有该基因的phage基因组文库，用一个Hcr9探针筛 选文库，获得37个含Hcr9的阳性克隆。经限制性酶切、DNA杂交 技术和DNA指纹技术，最终将含有至少一个Hcr9基因的所有的克隆 排列进三个主要的contigs，另外还有五个单独的克隆不能归入以上任 何一个contig中。其中的一个克隆能与CT116和Hcr9探针杂交，说 明该克隆是Orion位点的组成部分。应用PCR策略，对每个contig及 部分单独的克隆进行PCR反应，并将产物进行部分序列分析，然后与 目前所己失的Hcrg 基因簇的DNA序歹进行 b较发现：contig的四 个Hcrg分别与Moneymaker co）的NL位点的NL心。NL0、 NL．OD和 NL－OE非常相似，但缺少了 NL－OB。而另外一个单独的克 隆（克隆6）的Hcrg则与NL刀 非常相象。这些分析结果说明基因重复 （gene duplication）和基因移位（gene translocation）在 Hcrg 基因簇 的演变过程中，起了一定的作用。这些知识将有助于对Hcrg基因的 进化及新的Q基因序列产生机制的理解，从而为符合基因对基因学说 的R基因的进化提供根据。