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Germin基因的克隆和人溶菌酶基因的合成及其在烟草和油菜中的表达

王冰山  
【摘要】: 草酸作为真菌分泌的毒素并参与致病,目前已在核盘菌属等9个属中 有报道。草酸是核盘菌致病过程的决定因子,核盘菌在油菜、大豆、向日 葵与十字花科蔬菜等植物上引起严重的菌核病。油菜菌核病位于油菜三大 病害之首,由于核盘菌属广谱性非专化病原菌,油菜中至今未找到对病原 菌免疫的抗源。 鉴于草酸在致病中的重要作用,我们试图利用具有草酸氧化酶活性的 germin,从分解草酸入手进行抗菌核病的研究。本研究通过PCR扩增克隆 了小麦germin基因,构建了35S启动子驱动的germin基因植物表达载体, 经遗传转化获得了转基因烟草植株。经Southern杂交证明germin基因已 整合到烟草的基因组中。酶活性检测表明,源于单子叶植物小麦的germin 基因能够在双子叶植物烟草中表达并正常装配成具有酶活性的同源五聚体 蛋白。 对病原菌细胞壁降解酶的利用一直是抗病基因工程育种的一条重要途 径。人溶菌酶(human lysozyme,HL)是一种双功能酶,同时具有溶菌酶 和几丁质酶活性,并且杀菌活性较强。因此HL基因可能介导转基因植物 对细菌和真菌同时产生抗性。为了提高HL在植物中的表达量,我们根据 植物偏爱密码子,修饰、合成了适于在植物中表达的HL基因。设计的HL 基因序列中总G+C含量从原有的20.3%提高到了51.3%,密码子第三位碱 基的G+C含量由原来的41.5%提高到了59.2%。序列设计中还避免出现 mRNA多聚腺苷化的识别位点AATTAAA和mRNA代谢的识别信号ATTTA 等,以免导致mRNA不稳定。为验证合成的HL基因能否表达,我们构建 了HL的酵母表达载体,Western杂交表明HL基因能够在酵母中表达。进 而我们构建了35S启动子驱动的HL基因植物表达载体并转入烟草,为提 高表达蛋白的积累量并使其更有效发挥作用,我们将HL基因与大麦α-淀 粉酶基因的信号肽连接,指导HL表达产物分泌至细胞外。Southern杂交 证明HL基因已整合到烟草基因组。Western杂交证明了HL蛋白在转基因 烟草中的表达。 为了提高植物对核盘菌的抗性,我们构建了 germin基因和 HL基因的 双价植物表达载体,并转化了烟草和油菜。western杂交和草酸氧化酶活 性检测分别证明了双价基因中的 HL和 g6rmin在烟草中的表达。点杂交证 明了双价基因在油菜基因组的整合。


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