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莱茵衣藻外源基因高效转化系统的建立及金藻转化方法的研究

曹军平  
【摘要】: 本文对淡水微藻莱茵衣藻的转化方法进行了优化,建立了较 为完善的电击转化高效表达系统。研究了8种海洋微藻对8种陆 生植物基因工程中经常使用的选择剂的敏感性,首次研究了金藻 基因工程的选择剂,随后又进一步探索了金藻的转化方法。具体 研究内容和结果如下: 1.确定了莱茵衣藻在SE培养基中对Zeocin的敏感性,在液体培 养基中1μg/ml Zeocin就可以抑制莱茵衣藻的生长,在固体培养 基中10μg/ml Zeocin就可以抑制莱茵衣藻的生长。优化了电击 法转化莱茵衣藻的电容、电场强度、温度和渗透剂等4个参数。 高的转化率只有在电容为3.0×125μF及用渗透剂20mM山梨醇 +20mM甘露醇时,处理温度为0℃+室温(电击前在冰上放置 30分钟,电击后置于15-25℃培养)才能得到。得到的转化株在 无选择压的情况下已稳定保存了8个月。 2.研究了在陆生植物转基因时常用的抗生素如潮霉素、氯霉素、 G418、链霉素、头孢霉素、zeocin等及除草剂PPT,氨甲喋呤对 海洋单细胞藻—叉鞭金藻(Dicrateria inornata)、扁藻(Platymonas SP.)、小球藻(Chlorella SP.)、塔胞藻(Pyramidomonas SP.)、 牟氏角毛藻(Goniotrichum alsidii)、三角褐指藻(Porphyridium SP.)、新月菱形藻(Nitzschia closterium)、紫球藻(Porphyridium cruentum)的敏感性。结果表明:叉鞭金藻和肩藻对zeocin、G418、 氯霉素较敏感,在液体培养基中100μg/ml Zeocin、100ug/ml 的G418、340μg/ml的氯霉素可抑制叉鞭金藻的生长;在液体培 养基中200μg/ml Zeocin、600μg/ml的G418、340μg/ml的氯 霉素可抑制扁藻的生长。塔胞藻、牟氏角毛藻、小球藻、三角褐 指藻、新月菱形藻、紫球藻对潮霉素、G4、氯霉素、链霉素、 头泡霉素、氨甲碟吟、PPT、zeoc i n不敏感,不宜作为它们的选 择剂。G4、氯霉素、Zeocin适宜作为叉鞭金藻和扁藻转化的选 择剂。从实用化转基因的要求来看,我们需要在最短时间内筛选 出转化藻株,而本试验中 G4、氯霉素、Zeocin抑制叉鞭金藻 和扁藻生长的时间较长,因此需要进一步优化选择条件。 3.研究了叉鞭金藻在淡化10 倍的培养基中对腐草霉素家族的 Zeocin的敏感性,并用寇氏法计算zeocin对叉鞭金藻的半致死剂 量。当叉鞭余藻的细胞数目大约为 10‘个/ml 时,48 ’J’时的 LD。。二4.457。g/ml,95%的可信度为 3.452-5.462。g/ml,72 ’J’时 的 LD;。=l.85 u g/ml,95%的可信度为 0.83-2.87 u g/ml。以完整 的叉鞭余藻细胞为受体,以编码对腐草霉素家族有很强亲和力的 蛋白的 BLE基因作为选择标记,采用电击法,在 500-2500 V/cm 电场强度的范围内比较不同电场强度对金藻细胞的存活率。结果 表明,电场强度大于 1000 V止m时细胞的存活率很低(0~11%), 500~1000 V/cm 的处理细胞存活率较高(450~66O),500 V/cm 的电场强度下细胞存活率最高。但转化子在选择压 门。g/ml Zeocin)下存活时间过短,只有用 800 V儿m 处理的转化子能在 培养液中能存活15天。


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