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家蚕病原性微孢子虫的核糖体RNA编码基因的研究及其二级结构的构建

王见杨  
【摘要】: 本文对本室收集保存的九种微孢子虫(MCs、MD、ME、MG、MHa、ML、N.b、 MPa、MPr)的核糖体RNA的编码基因进行了研究,试图从基因水平上、分子水 平上对它们的亲缘关系进行探讨。并首次对微孢子虫RNA的抽提进行了探讨, 为进一步研究微孢子虫基因的差异表达等奠定了基础。 一、九种微孢子虫的核糖体小亚单位RNA(SSUrRNA)编码基因的研究 用碱发芽法、DNA-zol法、CTAB法共三种方法抽提了微孢子虫的基因组 DNA。三种方法均可用来大量抽提微孢子虫基因组DNA。抽提基因组DNA的质 量及数量与孢子新鲜度、孢子发芽率、破壁率、孢子浓度等有密切关系。 用PCR方法扩增、克隆、测序了九种微孢子虫核糖体小亚单位RNA(SSUrRNA) 基因的95%以上的序列。并用生物分析软件DNA-STAR、Clustalx对它们的序列 同源性进行了分析,构建了系统进化发育树。为这九种微孢子虫的亲缘关系的确 定提供了基因水平上的证据。 用生物软件构建了所测得的九种微孢子虫SSUrRNA基因序列的二级结构。 通过比较它们二级结构上茎的异同进一步为它们亲缘关系的确定提供了分子水平 上的证据。 九种微孢子虫SSUrRNA基因的序列同源性、系统进化发育树及二级结构均 表明它们同属于微孢子虫属(Nosema),是同属不同种。 二、家蚕微孢子虫核糖体小亚单位RNA(SSUrRNA)全基因的研究 用SSP-PCR的方法扩增、克隆、测序了九种微孢子虫核糖体小亚单位 RNA(SSUrRNA)基因3’-端的序列。经软件分析发现,其3’-端与蜜蜂微孢子虫 (Nosema.apis)SSUrRNA基因具高度同源性,两者有近140bp长的序列完全相同。 证明所扩增的序列是该基因的3’-端。测得家蚕微孢子虫SSUrRNA全基因为 1233bp,与文献报道相符。 三、菜粉蝶微孢子虫核糖体RNA基因的研究 用PCR方法扩增、克隆、测序了菜粉蝶微孢子虫SSUrRNA基因的3’-端,rRNA 基因内间隔区及LSUrRNA基因的580R区。与Genbank中对应序列比较后,鉴 中文摘要 定出SSUrRNA基因的3’-端,其全基因长为1244hp。基因内间隔区为41 hp,AT 含量相对较高。LSU洲A基因580R区为470hp,经软件分析发现,该序列与 。. NO SemQ·。lge。e具高度同源性。 四、微抱子虫SSUrRNA基因拷贝数的研究 以己克隆的家蚕微抱子虫(镇江株)的SSUrRNA基因为模板,用随机引物合 成法标记的探针在与九种微抱子虫及家蚕基因组DNA的六种酶切图谱的Southern 杂交的图谱上,显示了微抱子虫的 SSUrRNA基因拷贝数至少在 15个以上。 t h、微抱子虫RNA的抽提 本文首次报道了抽提微抱子虫RNA的详细方法。经比较发现,用异硫氰酸肌 法所抽提的NA的质量和数量均较好。抽提的RNA的质量及数量与抱子的新 鲜度、泡子发芽率、抱于浓度等同样有密切关系。


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