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表达禽流感病毒HA-NA、HA-NP及NP基因重组禽痘病毒的构建及其免疫效力的研究

乔传玲  
【摘要】: 禽流感(Avian Influenza,AI)是由A型流感病毒引起的禽类的感染和/或疾病综合 征,广泛流行于世界上许多国家和地区,给养禽业造成了巨大的经济损失。高致病力禽 流感(HPAI)多以突然发病和高死亡率为主要特征,常常导致感染鸡群的全群覆没, 被国际兽疫局列为A类烈性传染病。近几年来,在我国的一些地区也相继出现了AI的流 行,并于1996年,从广东鹅体内分离到对鸡具有高致病力的H5N1亚型AIV每株,这对 于我国的养禽业无疑是个极其危险的信号。一年后,97’香港禽流感直接传播给人并致 人死亡事件的发生,更加突出了AIV的公共卫生学意义。 为进一步阐明我国所分离的AIV毒株与香港流感毒株之间的关系,本研究对AIV A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)[GD3/96]的神经氨酸酶(NA)基因进行了RT-PCR扩 增、克隆与测序。结果所得到的NA基因cDNA包含完整的开放阅读框,全长为1410bp, 共编码469个氨基酸;通过与香港分离毒株A/Hongkong/156/97(H5N1)、A/Chicken/ HongKong/220/97(H5N1)、及A/Teal/Hongkong/W312/97(H6N1)和国内另一株鹅体分离 株A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)[GD1/96]进行序列分析,结果发现它们之间核苷酸序 列的同源性分别为89.1%、89.1%、88.4%和99.0%,氨基酸序列的同源性分别为90.8%、 90.8%、89.8%和99.2%,与香港流感毒株相比,GD3/96 NA的茎部没有19个氨基酸残基 的缺失。以上结果表明香港流感毒株的NA基因不是由我国大陆的AIV毒株直接进化而 来的。 AIV最大的特点是亚型众多、抗原变异频繁,因而研制一种能够防制所有亚型的AI 疫苗是极为困难的。本研究为克服当前疫苗在不同HA亚型之间交叉保护力低的弱点, 拟针对AIV的另外两种结构蛋白NP和NA构建重组禽痘病毒(rFPV)或者将它们与AIV 的主要保护性抗原HA在rFPV中实现共表达,以期研制一种具有更高交叉保护力的重组 病毒疫苗。 将AIV GD1/96的核蛋白(NP)基因和大肠杆菌β-半乳糖苷酶(LacZ)基因串联插 入到FPV载体中,构建能单独表达NP蛋白的rFPV转移载体;同时又分别将GD3/96 NA 基因和GD1/96 NP基因克隆到含有GD3/96 HA基因的重组转移载体中,构建含有HA- NA、HA-NP两种基因的转移载体。利用脂质体介导的方法将转移载体转染由亲本禽痘 病毒S-FPV-017感染的鸡胚成纤维细胞。依据标记基因LacZ在细胞中是否表达,蓝白斑 法筛选重组病毒,经数轮蚀斑纯化,PCR鉴定及Western-blot分析,结果证明所获得的重 组病毒rFPV-NP、rFPV-HA-NP、rFPV-HA-NA遗传性状稳定,并能够对其重组的单个或 两个外源基因进行高效表达,且在培养细胞中的表达产物具有与AIV蛋白相似的生物学 特性及免疫学活性。 将重组病毒rFPV-HA-NA、rFPV-HA-NP、rFPV-NP和rFPV-HA分别经翅下刺种途径 免疫8周龄SPF鸡,同时设S-FPV-017免疫组和空白组对照。免疫后4周,分别用HPAIV GD1/96(H5N1)和KP(H7N1)进行致死剂量的攻击。通过检测血清学抗体和外周血液中 乔传玲 裹达内沉@清骂HA.NA.HA川P及NP g因重姐禽伍病霉的沟巨及耳免疫过力的研穴 中日农业科学院 CD3”、CD4”、CDS”及y8TCR”四种亚类T淋巴细胞的含量以及攻毒后鸡群消化道排毒、 发病和死亡情况来综合评价重组病毒的免疫效力。结果rFPV免疫后,所有鸡均被诱导产 生了高水平的*抗体和NP一、NA-特异性ELISA抗体::FPV-HA-NA与其它免疫组相比, 诱导产生*抗体的时间提前了一周。T淋巴细胞的检测结果表明rFPV免疫能有效激发机 体的细胞免疫应答,使免疫活性T细胞活化增殖,各类T细胞的百分比例均有所升高, 并且显著降低了因病毒攻击所导致的T淋巴细胞比例的下降幅度;而所有的对照鸡在攻 毒后,各类T淋巴细胞的百分比例均大幅度降低。rFPV-HA-NA、rFPV-HA-NP和rFPV-HA 免疫组对HSNI病毒的攻击均获得了100%的保护,它们对HWI毒株攻击的保护率分别 为100%、40%和0,而rFPV-NP免疫组对两种亚型病毒的攻击分别获得了40%和30%的保 护:S-FPV-0门免疫组和空白对照组在攻毒后全部发病并死亡。重组病毒FFPV-HA-NA、 rFPV.HA.N-I,和rFPV.HA免疫组用HSNI病毒攻击后,在鸡的泄殖腔中都没有检出病毒的 存在,而rFPV-NP、S-FPV-0门免疫组和空白对照组均分离到了病毒的存在;当用H7NI 病毒进行攻击后,rFPV-HA-NA、rFPV-HA-NP、rFPV-NP和rFPV-HA免疫组病毒分离阳 性率依次为10O、250、33.3O、100o,而S-FPV-017免疫组和空白对照组均为100O阳 性。以上结果表明rFPV在鸡体内都能够稳定复制和高效表达外源蛋白,井能够诱导机体 产生特异性的体液和细胞免疫应答反应:表达产物中NA和*A是最具有免疫原性的,二 者的共表达能够使免疫鸡完全抵抗HSNI和H7NI亚型HPAIV的致死性攻击。 最后对rFPV-HANA的兔疫日龄、兔疫产生时间、免疫持续期及最小免疫剂量进行 了测定,结果大约含!0个PFU的重组病毒即能够诱导机体产生 100%抵抗强毒攻击的保 护力:免疫接种1日龄叩r鸡,4周后能完全抵抗*队IV的致死性攻击:两周和三


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