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农杆菌介导的转座子水稻突变体库的构建

朱正歌  
【摘要】: 转座子标签法克隆异源植物的基因,是功能基因组学研究的重要手 段。目前T-DNA标签与转座子标签相结合,已成功地构建了拟南芥等植 物的突变体库,在水稻功能基因组研究中也取得一定进展。 本研究利用农杆菌介导的高效水稻遗传转化法,将玉米转座子Ac (AcTpase)、Ds(Dissociation)分别导入粳稻品种中花11,所用质粒为 pDsBarl300(含Ds因子)和pUBITs(含Ac片段)。对其中387个独立 的转化株系进行了形态及分子生物学检测;对转基因过程中出现的矮秆、 雄性不育、抗纹枯病等突变体进行了形态及分子生物学分析。构建了354 个杂交群体,其中Ac×Ds杂交群体308个,Ds×Ac杂交群体46个,并 对Ds因子在杂交群体中的转座活性进行了检测,对转基因植株中Ds因 子的原初插入位点及新的转座位点的旁侧序列进行了分析。 主要结果如下: 1.转基因植株的PCR扩增和Southern杂交检测表明,Ac/Ds确已整合到 水稻基因组中。对96株转Ds因于T_0植株的Southern杂交检测表明, 63.5%为1个插入位点,20.8%为2个插入位点。对T_1代植株的Southern 杂交检测表明,Ds因子在基因组中可稳定遗传给子代。 2.质粒pDsBarl300中Ds与Bar紧密连锁,通过Basta抗性检测可判断 Ds因子在基因组中的整合情况。对364株转Ds+Bar的T_0植株进行 Basta抗性分析,95.0%为抗性植株,说明本研究所利用的转化系统效 率很高。对279株系T_1代植株Basta抗性分析表明,185株系呈3:1 分离,39株系呈15:1分离,55株系呈不规则分离,说明66.3%的 转化植株外源基因为1个插入位点,14.0%的转化植株外源基因为2 个插入位点,19.7%的转化植株外源基因为多个插入位点,这些均与 Southern杂交检测结果基本一致。Southern杂交和Basta抗性检测还 表明,来自同一愈伤组织的转基因植株不一定来自同一克隆。 3.转Ds因子的T_0植株的T-DNA插入位点的旁侧序列分析表明,不同 的转化植株Ds因子插入位点相同或相距很近。如T276-1,T287和 T434-2其Ds插入位点相同;T331-2与T220a-1插入位点相同,二者 与T383的插入位点仅相差9个bp;T389与T370-1的插入位点相差 197个bp。26个Ds插入位点的旁侧序列中,有17个插入位点互不相 同,占65.4O厂说明T·DNA与基因组的整合过程中有可能存在插入热 点。检测到有些Ds因子插在了编码蛋白的基因组中,如转基因植株 T369的DS因子插在6-磷酸-葡萄糖转位酶的基因中。 4.PCR方法检测杂交群体中DS因子的转座活性,从395株FZ植株中, 筛选出既含 DS因子又含转座酶基因的植株 132株,用 PCR方法对 DS 因子的转座情况进行检测,结果表明,其中有 3 0株 Ds因子从原插入 位点切离,转座频率为22.7%。利用inverse-PCR(反向PCR法)检 测Ds转座前后插入位点的旁侧序列,进一步证明了DS因子确己转座 到新的位点。本研究表明,DS因子从原插入位点切离再转座时有以下 几种方式:()多数情况下遵循的是“切-粘”机制:(2)有时DS复 制一个拷贝插入到新的位点,而原插入位点的Ds仍停留在原来的位 置,如 K277q和 K277-2是来自同一个杂交组合的 FZ子代,K277J 遵循“切-粘”机制,K277-2是复制一个拷贝转座:(3)DS从原插入 位点解离时,有时会带着旁边的部分序列一起转座,如 A314.3中 DS 因子与其旁侧的37bpLacZ序列一起转座到了新的位点。本研究还发 现原初插入位点不同的Ds因子有时会转座到相同的位点。获得了9 个Ds转座到新位点的有Ds标记的水稻基因组片段,而且与GenBank 中的数据没有同源性。目前己有2个片段在GenBank登录,登录号为 AF355153和 AF355770。 5.转基因植株及其后代出现了一些可见的形态突变,包括矮秆、雄性不 育、抗纹枯病、白化苗、黄苗、抽穗早、抽穗迟、不抽穗、匍匐茎及 白条斑叶片等类型,有些突变呈典型的Mendel分离比。形态及分子 生物学检测表明,有些突变为非Ds因子插入直接引起的。 6.利用AFLP银染标记研究方法,采用4碱基切点的Msel与6碱基切点 的EcORI对基因组DNA进行双酶切,对矮秆突变体、雄性不育突变 体进行进行AFLP分析。随机筛选120个引物组合,找到了一个与高 秆性状连锁的AFLP标记,分子量为300hp。随机选取105个AFLP 引物组合对雄性不育基因池、雄性可育基因池及中花门对照基因池进 行检测,在不育池中找到了一个特异带。


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