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水稻内生优势成团泛菌YS19对宿主侵染和定殖机制的研究

冯永君  
【摘要】: 本文首次以水稻(Oryza sativa)“越富”品种为模式植物,以水稻内生优势 成团泛菌(Pantoea agglomerans)YS19为模式内生细菌,系统地研究了成团泛菌 YS19对宿主水稻侵染和定殖的机制。 研究发现,成团泛菌YS19在培养基生长可分为两个阶段:在指数生长期 前为散生状态,在进入减数期后开始形成聚集成团的共质体symplasmata结构。 筛选了成团泛菌YS19利福平突变株YS19B,并用其与绿色荧光蛋白(GFP) 基因供体大肠杆菌(Escheichia coli)cc118λ/pFAJ1820接合,得到接合重组子 成团泛菌YS19B::gfp,能产生明亮的绿色荧光。标记菌株与野生型菌株相比最 大比生长速率和最大生物量仅减小12.4%和6%,代时延长14.0%,说明标记后 成团泛菌YS19B::gfp的生长仅受到较小影响,不致对成团泛菌的生理活动造成 大的改变。建立了标记菌株在有标记丢失存在时的生长动力学模型,解析出细 胞分裂时标记丢失的概率为9.756×10~(-7),说明标记稳定性比较高。荧光分析发 现,标记菌株的λ_(exmax)为400nm,λ_(emmax)为508nm。在LB培养基上生长时, 成团泛菌YS19B::gfp培养至20h时GFP产量达到最高。在饥饿状态下培养时, 虽能造成标记菌体细胞死亡,但存活菌体荧光强度并不改变。因而该标记菌株 适合进一步应用于植物和微生物相互作用的研究中。 用激光扫描共聚焦显微镜技术研究了成团泛菌YS19B::gfp在水稻根部的定 殖规律:在水稻幼苗的幼根上内生细菌的数量多于老根,而幼根上内生细菌在 伸长区的数量最多;侧根发生处的裂痕和根冠是发生侵染的重要部位,同时也 是该菌定殖的热点部位。用电子显微镜技术研究了悉生培养状态下成团泛菌 YS19对水稻植株的侵染和定殖,发现成团泛菌YS19在自由培养形成 symplasmata结构时,菌体细胞由长杆状变为短杆状,单个菌体的体积缩至原来 的30%;成团泛菌YS19在侵入到水稻体内后,在根茎叶等多种组织内都能形 成symplasmata结构,组成symplasmata的菌体细胞仅为体外自由培养的菌体 细胞体积的20~30%。研究表明,symplasmata结构可能是内生定殖适应性的产 物,根据氧气在细胞团内的扩散模型计算推断,该结构应当有利于成团泛菌YS19 发挥固氮作用。成团泛菌YS19在叶表定殖的数量要高于在根部定殖的数量。 侧根发生处的裂缝和根毛是内生细菌进入植物的重要场所。成团泛菌 YSIg主 要定殖在根皮层薄壁组织、茎薄壁组织和中央基本组织内,在维管柱内的存活 数量较少。维管组织和叶面气孔、水孔可能是内生细菌转移定殖位点实现再分 布的主要依托。 测定了成团泛菌 YS在水稻幼苗根上的吸附等温线(25 ’C)和吸附速率, 该菌在水稻根部单层吸满吸附量q。为 1.43X10‘mg“‘,其吸附系数口为 2.35X 10”‘;成团泛菌作为水稻优势内生细菌吸附速率明显高于对照菌株。表明内生 细菌在侵染植物的过程中,在吸附阶段就已表现出很强的选择性和特异性,提 出了吸附系数可作为内生细菌侵染和定殖的能力指数(Infection nd coloniZation Potental index,ICPI)来判断内生细菌与宿主植物的亲和性。吸附系数最高的内 生细菌在侵染和定殖上是有优势的内生细菌。 在悉生条件下研究了成团泛菌 YS对水稻的促生作用。不接内生菌的水 稻苗在无N源RCV培养基中最多只能生长28 d,而接了内生菌的水稻苗能旺 盛生长 60 d以上。培养 12 d后接菌组水稻苗的平均质量为 49.5 mg,比未接菌 的水稻苗增加 63.4%,经统计学分析表明接种成团泛菌 YSIg对悉生无氮培养 水稻苗的促生作用极为显著(显著水准a二0刀1),这当与内生联合固氮作用有 直接关系。 用Fluorescent Brightener 28荧光染色发现,成团泛菌几乎不能产生可检测 到的胞外多糖,因而推测成团泛菌 YS Symplatthats结构胞外基质主要成分可 能是蛋白质,并命名为胞外基质蛋白忙xtracellular matrix protein,ECMP卜探索 了ECMP的分离方法,用离子交换和分子筛层析分离纯化了其中的一种ECMP 组分,达到了 SDS-PAGE电泳纯,分子量为 ZI,200 D,为进一步研究 s帅plasmata 的结构和功能奠定了基础。


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