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植物油体表达体系的建立及Profilin2维管束特异表达启动子的区段缺失分析

刘昱辉  
【摘要】: 本论文的目的是:(1)建立在植物油体中表达外源蛋白的表达体系,以简化 目的蛋白的分离纯化过程;(2)对维管束特异表达的Profilin2启动子进行区段分 析,寻找控制维管束特异表达的区段和元件,为在抗维管束病害的基因工程中 使抗病基因产物直接在维管束中特异表达并对病原体建立防御体系,以节省能 量,同时增加转基因作物的安全性。 为建立油体表达体系,本论文进行了以下研究:(1)分离和克隆了油菜 Oleosin基因的启动子及编码芝麻Oleosin蛋白的结构基因。(2)克隆了鲑鱼降钙 素的突变基因msCT[Ser~6,des-Leu~(19)],将其插在芝麻油体蛋白Oleosin基因的C 端。据文献报道,鲑鱼降钙素(sCT)在治疗缺钙症等中有明显的疗效。(3)构 建了由油菜Oleosin基因启动子驱动的Oleosin-Calcitonin融合蛋白植物表达载 体,转化油菜和棉花,获得了转基因植株。转基因油菜经PCR检测,证明降钙 素基因已整合到油菜基因组中。转基因棉花经PCR-Southern和Western检测, 证明msCT基因在棉花中整合并在油体中表达。目前已得到T_2代转基因棉花株 系44个,由于在田间对T_1、T_2代植株的叶片用高浓度(5000 ppm)的卡那霉素 溶液涂抹,故筛选出的Kan~R株理论上应为高表达的个体。用植物油体表达体系 在转基因棉籽油中表达鲑鱼降钙素,在文献中尚未见报道。 在Profilin2维管束特异表达启动子的区段分析中,根据Pfn全长启动子 (Pfn1.7,-1667~-1bp)及其5’端4种不同长度(Pfn1.4、Pfn1.2、Pfn1.0、Pfn0.6) 的缺失分析,检测gus基因在转基因伽蓝菜中的表达,可将Pfn全长启动子分 成三部分:区段A,-1667~-1380 bp,缺失该区段(Pfn1.4),由维管束特异表 达变为组成型表达,由此推测在该区段内存在维管束特异表达的元件。区段B, -1153~-597bp,强烈抑制gus基因的表达,推测在该区段中存在负调控因子。 区段C,-597~-1bp,即Pfn0.6,除在维管束中表达较强外,还在薄壁细胞中 表达,故可认为该区段是Profilin2的基本启动子。进一步分析发现,Profilin2 启动子在-1391~-1388 bp处及-565~-562bp处各有一个bZIP蛋白结合位点 的核心序列ACGT(bZIP蛋白是植物中最丰富的一类转录因子);-1647~-1640bp 处有一个与控制菜豆苯丙氨酸氨裂合酶2(PAL2)维管束特异表达的序列AC-I (CCCACCTACC)相类似的序列(CCACCTAC)。为弄清ACGT及AC-I序列在 Profilin2启动子中是否调控维管束的特异表达,我们又分别构建了P1(-1667~- 刃 县 1403,含 AC-l)、PZ(如27一羽80,含 ACGT)、P3(-1667~羽80,含 ACGT 和AC-1)、P4(-1667一1627,含AC-l)、PS(-1403一1376,含ACGT)等五 个不同区段与80 hp CaMV35S最小启动子(P35Sm)连接的融合启动子,构建 植物表达载体,转化烟草和伽蓝菜。在烟草短暂表达中,PZ(含ACGT)启动子 的表达强度明显高于n(含AC0,推测bZIP蛋白结合序列ACGT在调控表 达强度方面可能起更重要的作用。转基因烟草的稳定表达结果表明,P135Smfus 构建物(含AC工序列)仅在茎、叶维管束中检测到GUS表达。鉴于355最小启 动子在植物的所有发育阶段都不能表达,故说明AC.I作为一个顺式作用元件 k七lementX 确能调控维管柬的特异表达。其余构建物因目前仅得到转基因 的小芽,尚不能进行检测,故其对稳定表达的影响尚待进一步研究。据作者所 知,这是首次对profilinZ启动子进行的区段缺失和基元序列分析。


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