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大麦黄矮病毒GPV株系ORF5基因的克隆、表达载体构建及转基因研究

许雷  
【摘要】: 将已经测定的GPV株系ORF5部分基因序列与RPV株系的序列进 行比较,根据ORF5起始区域的核苷酸序列合成上游引物,以RPV ORF5 基因框架3’外侧核苷酸及编码氨基酸序列作为参考,设计3’简并引 物,以GPV ORF5基因组RNA为模板,RT—PCR扩增GPV ORF5基因片段, 用pGEM-T载体克隆扩增片段。对克隆基因片段进行序列分析结果表明, ORF5全长1326个核苷酸,可编码441个氨基酸、分子量为50kD左右 的蛋白质。这是首次获得GPV株系ORF5基因完整序列。 与其他黄症病毒ORF5基因核苷酸序列进行比较的结果显示,GPV 与RPV的同源性最高,同源性达68.1%;与马铃薯卷叶病毒(PLRV) 和甜菜西方黄化病毒(BWYV)的同源性次之,分别为33.6%和39.8%, 与PAV、SGV、GAV、MAV的同源性分别为30.2%、28.8%、28.5%和29 %。根据核苷酸序列推测出ORF5基因编码的氨基酸序列,对GPV株系 与本组其它病毒的氨基酸序列等进行比较,结果显示GPV与RPV的同 源性最高,为72.4%,与PLRV、BWYV的同源性次之,分别为31.4%和40.5 %,与PAV、SGV、GAV、MAV的同源性最低分别为、25.6%、22.6%、 25.1%、26.5%。根据最新的植物病毒分类研究进展,RPV、PLRV和 BWYV均属于黄症病毒科的Polerovirus属,根据ORF5基因的序列分析 和基因序列同源性比较结果,初步推测分离自中国小麦黄矮病株上的 GPV株系在分类上属于黄症病毒科的Polerovirus属。 对由GPV ORF5和RPV ORF5基因核苷酸序列推测出的氨基酸片段 进行氨基酸组成、部分理化性质及计算机模拟的蛋白结构模块进行比 较。结果显示尽管GPV ORF5与RPV ORF5存在同源性,但两者在氨基 酸片段长度、氨基酸组成、部分理化性质及蛋白结构模块的组成和分布 上有较大的差异。 大麦黄矮病毒GPV株系Ohs基因的克隆、表达载体构建及转基因研究 根据测定的基因序列,分别设计合成含有酶切位点的ORFS的5’端 (含Xbl和起始密码AUG)和3’端(含K列)引物,通过RTICR方 法扩增Ogys基因片段,将基因片段经过Xbopnl双酶切后插入到 pGEM—3Z质粒中,兰白斑筛选重组质粒,提取质粒,Hindlll酶切、 ienow酶补平、EcoAI二次酶切,切下带粘平端的ORFS基因片段,插 入经Ndel酶切冲平/EcoM二次酶切的原核表达载体 pET6 中,筛选 重组质粒,完成Ogys基因片段的非融合原核表达载体的构建。重组质 粒转化进受体菌 BL21(DE3),IPTG诱导 GPV ORFS基因的非融合表达, SDS—PAGE分离表达产物,发现诱导后产生一个50KD左右的蛋白组 份,与根据基因序列推导出的蛋白质分子量相近,western杂交分析表 明,该诱导出的蛋白可与GPV发生血清学反应。 RT—PCR扩增的ORFS基因片段用Xbal/Knl双酶切后插入到带相 同双酶切位点的含有Emu启动子和Nos终止子的质粒pEmu-mes-N之 中,构建成用于小麦转化的植物表达载体 pPPI(ORFS重组质粒人 利用花粉管通道方法,与含有Bar基因的质粒pACH—20进行双质粒共 转化,转化品种选自我国小麦黄矮病高发区的高产、优质、不抗病的小 麦品种陇鉴127、晋麦47,每个品种转化小花数均在1000个以上,收 获种子数分别为74粒和sl4粒。 播种转化种子,提取小麦总DNA,进行PCR检测,结果得到3株 阳性的 T。代植株,2株为陇鉴 127、l株为晋麦 47。对阳性植株的 DNA 进行PCR、PCRSouthem、Southern分析,均获得阳性的杂交结果。表 明转基因小麦后代中存在看己整合进染色体的GPV株系ORFS基因。


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