抗菌蛋白AP1编码 基因转化马铃薯和烟草及其对青枯病抗性研究

【摘要】： 根据已知马铃薯抗青枯菌蛋白AP1编码基因ap1序列，合成了一对特异性 引物P_1/P_2，分别引入限制性酶切位点AccI及XhoI。以P_1/P_2为引物，以ap1基 因原核表达载体pAP217为模版，经PCR扩增得到1.2kb的ap1基因片段。选取 质粒pGΩ4A为过渡载体，以AccI和XhoI双酶切ap1基因片段，与经同样双酶 切的pGΩ4A线性分子相连接，经转化、筛选，成功构建了有ap1基因的植物表 达盒‘2E-35S-Ω-ap1’的中间载体pAP4A。以EcoRI及HindIII双酶切pAP4A， 得到这一表达盒片段，然后与经同样双酶切的植物表达载体pBI121相连接，经 转化、鉴定，获得了ap1基因的植物高效表达载体pHap1。 以电激法将pHap1导入根癌农杆菌LBA4404，用叶盘法分别转化马铃薯青 枯病感病品种米拉（Mira）、中-5-1、金冠以及烟草感病品种NC89的无菌试管 苗。经愈伤诱导及卡那霉素（kan）筛选，分别获得了16株米拉、8株中-5-1、 5株金冠以及40株NC89的kan抗性再生苗。经PCR、Southern和 Northern-bloting等分子检测，表明apl基因已成功整合到转基因植株染色体 上并正确转录。 分别选取米拉的两个转基因株系Ts-M-2和Ts-M-5，以及烟草的8株转基 因植株，进行温室青枯病抗病性鉴定。结果表明，转基因植株的抗病性比非转 基因植株对照明显提高，表现为发病或出现萎蔫症状的时间延迟和病情指数降 低。 根据ap1基因序列在网上的同源性分析，发现其在同源性排列中分值最高 的是酸性磷酸酶蛋白家族。对ap1基因的大肠杆菌表达产物融合蛋白及其转基 因植株的粗蛋白，进行酸性磷酸酶活性测定，结果表明，ap1基因的表达产物与 对照相比具有明显增加的酸性磷酸酶活性。