蓖麻蚕线粒体DNA片段的克隆和序列分析

【摘要】： 利用蓖麻蚕花篮的蚕蛹为材料，提取蓖麻蚕线粒体DNA（mtDNA），与质 粒pSK(+)(Amp~r)载体分别经EcoRI和XbaI双酶解，再经过连接、转化等， 筛选出两个重组体，经酶切鉴定，证明获得了蓖麻蚕mtDNA EcoRI-XbaI 1.0kb和3.0kb两个克隆片段，并进一步进行序列分析。 对两个克隆片段进行了部分序列测定、比较和分析，推定蓖麻蚕mtDNA EcoRI-XbaI 1.0kb中包含细胞色素氧化酶亚基Ⅲ（COX3）基因，甘氨酸tRNA 基因（tRNA-Gly）和NADH氧化还原酶亚基Ⅲ（ND3）基因5’端的部分序列 （GenBank Accession NO. AF288145）。蓖麻蚕线粒体COX3基因编码框包含 789个核苷酸，编码262个氨基酸的蛋白质；tRNA-Gly基因长度为66bp，与 家蚕线粒体tRNA-Gly基因同源性为98.48％，缺少可变环；ND3基因的部分 序列含151个碱基，与家蚕线粒体ND3基因的对应的核苷酸同源性为 73.51％，蓖麻蚕的起始密码子为ATT，而家蚕为ATA。蓖麻蚕mtDNA EcoRI -XbaI 3.0kb中包含NADH氧化还原酶亚基Ⅵ基因（ND6）、细胞色素b基因 （Cytb）和16srRNA基因的部分序列，三者与家蚕的相应片段的同源性分别为 64.9％、75.2％和80.4％，由于皆为基因的部分序列，实际二者的同源性也会 有所出入。 利用我们克隆的蓖麻蚕线粒体COX3基因序列，并通过检索GenBank的 其它16种mtDNA COX3序列，进行了线粒体COX3序列同源性比较，并进行 了分子系统演化方面的探讨。同源性比较发现COX3基因的3′端比5′端更保 守，其编码的蛋白在C端有两个保守序列存在；蜜蜂与其它所有的物种同源 性最低；蓖麻蚕的COX3与家蚕COX3同源性最高，核苷酸和氨基酸序列同源 性分别是80.23％和85.6％，蓖麻蚕与5种脊椎动物的同源性均较低。mtDNA COX3编码氨基酸组成中丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、谷氨酸、苯丙 氨酸、丝氨酸和苏氨酸的含量较高，精氨酸、半胱氨酸等的含量较低；疏水 性氨基酸的含量为43．30％～48．47兄蜜蜂的COX3氨基酸组成与其它物种差 别较大；蓖麻蚕与家蚕的组成变化不大。基于 mtDNA COX3核昔酸和氨基酸 序列的分子系统树基本一致，仅仅物种间的距离稍微有所变化。基于mtDNA COX3序列数据构建的分子系统进化树基本上可反映一组物种的亲缘关系，但 东亚飞蝗和蜜蜂在分子系统树中与形态系统中的结果明显不同，可能与生态 环境及繁殖方式有关。因此，在采用线粒体基因序列进行分于进化分析时， 应该综合考虑其繁殖模式及生态特点。